李明秀　劉志強(qiáng)　許振　楊世慧

[摘要]目前，宮頸癌仍是全球范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其中90%宮頸癌患者伴有人乳頭瘤病毒（HPV）的感染，以高危型HPV 16和18型為主。高危型HPV E6/E7基因是造成細(xì)胞永生化和腫瘤進(jìn)展的主要原因，病毒基因組整合到宿主基因組是癌基因E6和E7致癌的關(guān)鍵步驟，大量研究證實(shí)E6和E7基因可以導(dǎo)致p53和pRb兩個(gè)重要的抑癌基因失活，而最新的研究表明這兩種基因可以作用于更多的細(xì)胞因子，如細(xì)胞的甲基化狀態(tài)、PI3K-AKT通路、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）等，對(duì)這些因子的不同影響最終導(dǎo)致了癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸等。

[關(guān)鍵詞]E6/E7;人乳頭瘤病毒;宮頸癌;PI3K-AKT;甲基化;基質(zhì)金屬蛋白酶;免疫機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R711? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）6（a）-0023-05

[Abstract] At present， cervical cancer is still the most common reproductive system malignant tumor in women worldwide， and 90% of patients with cervical cancer are infected with Human papillomavirus （HPV）， among which high-risk HPV types 16 and 18 are the main types. High-risk HPV E6/E7 gene is the main cause of cell immortalization and tumor progression. The integration of the viral genome into the host genome is a key step for oncogenes E6 and E7. A large number of studies have confirmed that E6 and E7 genes can lead to the inactivation of two important tumor suppressor genes， like p53 and pRb， the latest researches have shown these two genes can act on more cytokines， such as cell methylation status， PI3K AKT pathway， matrix metalloproteinases （MMPs）， and interleukin-18 （IL-18）， and different effect on these factors ultimately lead to the occurrence， metastasis and immune escape of cancer.

[Key words] E6/E7; Human papillomavirus; Cervical cancer; PI3K-AKT; Methylation; Matrix metalloproteinase; Immune mechanism

人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一種屬雙鏈閉環(huán)的球形小DNA病毒，在惡性腫瘤中，HR-HPV DNA首先與宿主細(xì)胞內(nèi)的染色體整合，然后表達(dá)病毒E6、E7癌基因轉(zhuǎn)錄形成E6/E7 mRNA，進(jìn)一步翻譯形成E6、E7蛋白，E6和E7蛋白可以降解pRb蛋白使宿主細(xì)胞進(jìn)入S期，使病毒不斷復(fù)制，同時(shí)E6蛋白可以降解p53蛋白，逃避凋亡，使細(xì)胞分裂不受控制，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定的發(fā)生，這為腫瘤的發(fā)生提供了前提條件，其表達(dá)水平與宮頸病變的進(jìn)展程度及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化關(guān)系十分密切。本文主要從以下4個(gè)方面介紹HPV E6/E7基因在宮頸癌發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 E6/E7蛋白調(diào)節(jié)甲基化狀態(tài)

癌癥是由許多因素引起的疾病，近期研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)是其中一個(gè)主要因素，通過(guò)改變細(xì)胞微環(huán)境在癌癥發(fā)展中起重要作用。DNA甲基化是用于修飾基因功能的表觀遺傳機(jī)制之一，不改變細(xì)胞的核苷酸序列[1]。研究表明，HPV感染細(xì)胞與細(xì)胞基因啟動(dòng)子高甲基化密切相關(guān)，并抑制其轉(zhuǎn)錄[2-3]。在感染HPV的細(xì)胞中觀察到位點(diǎn)特異性甲基化的現(xiàn)象，其中87%的位點(diǎn)位于甲基化可變位置（MVP）的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CPG），該位點(diǎn)顯示病毒陽(yáng)性的細(xì)胞甲基化增加。有研究者用人角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)染E6/E7基因后進(jìn)行甲基化特異性檢測(cè)，其數(shù)字核型分析顯示，有34個(gè)基因顯示甲基化增加，同時(shí)基因表達(dá)下降[4]，這進(jìn)一步驗(yàn)證了E6/E7蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞甲基化狀態(tài)，干預(yù)細(xì)胞基因正常轉(zhuǎn)錄。其中，E-鈣粘蛋白參與上皮中病毒的檢測(cè)，是HPV功能上重要的甲基化靶點(diǎn)，它與其他刺激信號(hào)協(xié)調(diào)朗格漢斯細(xì)胞通過(guò)上皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，從而增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)的刺激來(lái)清除生物體中的病毒。在HPV感染的細(xì)胞中，E-鈣粘蛋白表達(dá)較低減少了朗格漢斯細(xì)胞的遷移，從而降低了上皮細(xì)胞的病毒清除率。然而，E6和E7都能通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）的活動(dòng)下調(diào)E-鈣粘蛋白，而且E6的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致E-鈣粘蛋白表達(dá)降低以及DNMT活性增加。相關(guān)研究表明，在高危型HPV感染細(xì)胞中，E6癌蛋白主要通過(guò)降解p53來(lái)增加DNMT1的表達(dá)和活性。E7調(diào)控DNMT1的過(guò)程分為兩種途徑，在間接機(jī)制中，E7與pRb結(jié)合并釋放一種存在于DNMT1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活DNMT1的啟動(dòng)子;在直接機(jī)制中，E7直接與DNMT1結(jié)合，導(dǎo)致DNMT1的構(gòu)象變化，并暴露活性位點(diǎn)，使E7/DNMT1與DNA的結(jié)合，在E7與復(fù)合物解離后形成穩(wěn)定的DNMT1/DNA復(fù)合物，由于腫瘤抑制基因的沉默，這導(dǎo)致基因組的甲基化，并導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[5]。另外，E7和DNMT1對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白A1即細(xì)胞周期素A1（CCNA1）基因的啟動(dòng)子有直接作用，這種相互作用已經(jīng)在體外通過(guò)芯片實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E7和DNMT1均位于CCNA1啟動(dòng)子上，導(dǎo)致CCNA1的表達(dá)受到抑制[6]。通過(guò)這個(gè)發(fā)現(xiàn)，有研究提出利用CCNA1的甲基化狀態(tài)作為一個(gè)潛在的區(qū)分正常宮頸、低級(jí)別和高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的生物標(biāo)志物[7]。趨化因子CXCL14也被鑒定為E7的甲基化靶點(diǎn)，其參與調(diào)控體內(nèi)許多生物學(xué)過(guò)程，如炎癥反應(yīng)、腫瘤的血管生成、腫瘤的特異性免疫激活以及腫瘤的自分泌調(diào)節(jié)等，E7蛋白作用于CXCL14的啟動(dòng)子并形成高甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致其抑制腫瘤血管生成的功能失活，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[3]。總之，E6/E7蛋白通過(guò)誘導(dǎo)DNMT的表達(dá)，導(dǎo)致異常的DNA甲基化和正常表觀遺傳過(guò)程的破壞，進(jìn)而使調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、參與細(xì)胞凋亡和粘附的基因表達(dá)水平發(fā)生改變，最終走向腫瘤的結(jié)局[6]。

2激活磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）通路

近年來(lái)，PI3K-AKT途徑已被多次證明其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，尤其是與HPV相關(guān)的癌癥，該通路通過(guò)改變其靶基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞和分子功能，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、代謝、凋亡、遷移、侵蝕及血管生成等[8]，這些調(diào)節(jié)關(guān)系到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和結(jié)局，因此這條道路已被提議作為許多癌癥（包括宮頸癌）有希望的治療靶標(biāo)。其中，PI3K通過(guò)調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活，防止細(xì)胞凋亡，是腫瘤發(fā)展的加速劑[9]。而AKT的磷酸化通過(guò)刺激AKT的催化活性，導(dǎo)致靶基因的磷酸化，產(chǎn)生一系列的生物學(xué)行為，如細(xì)胞的增殖、動(dòng)員、存活以及血管的生成和抗凋亡能力，最終導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步發(fā)展與轉(zhuǎn)移，甚至產(chǎn)生耐藥性[10]，影響患者預(yù)后。研究表明，E6/E7蛋白可通過(guò)多種細(xì)胞及分子事件激活PI3K-AKT通路，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[11]。E6蛋白還可通過(guò)上調(diào)PI3K激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，且PI3K的活性在MAPK通路的不同水平都發(fā)揮著重要的誘導(dǎo)作用，E6蛋白通過(guò)PI3K間接作用于MAPK通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)[12]，鈉氫交換調(diào)節(jié)因子1（NHERF-1）是一種分子途徑組織者，其在細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞募集，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞骨架信號(hào)蛋白轉(zhuǎn)化為功能復(fù)合物等作用。E6蛋白主要通過(guò)降解NHERF-1、激活PI3K-AKT通路這兩種重要途徑在腫瘤形成的過(guò)程中發(fā)揮作用，而E7蛋白可以激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物進(jìn)一步促進(jìn)E6蛋白對(duì)NHERF-1的降解。研究發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸308位點(diǎn)和絲氨酸473位點(diǎn)的磷酸化是E7蛋白激活A(yù)KT的關(guān)鍵位點(diǎn)，隨后AKT的激活作用于相關(guān)死亡啟動(dòng)因子（BAD）并使其磷酸化，減少了與Bcl-xl和Bcl-2的結(jié)合，阻止細(xì)胞色素C釋放入胞漿，從而抑制細(xì)胞凋亡。另外，E7蛋白也可以通過(guò)結(jié)合和隔離已知的結(jié)合配體來(lái)維持AKT基因處于活躍狀態(tài)，從而抑制AKT基因的去磷酸化，活躍的AKT基因激活MDM2癌基因，增加p53降解并導(dǎo)致pRb失活，進(jìn)一步加強(qiáng)已建立的E6/E7對(duì)p53和pRb功能的影響[13-14]。據(jù)報(bào)道，蛋白磷酸酶2（PP2A）屬于絲氨酸蘇氨酸磷酸酶，其與P-AKT的35 kDa催化和65 kDa結(jié)構(gòu)亞基相互作用，導(dǎo)致AKT的磷酸化，干擾細(xì)胞凋亡過(guò)程。此外，HPV E7蛋白與兩個(gè)PP2A亞基結(jié)合，以防止它們與P-AKT相互作用，從而維持AKT通路的激活。E6、E7蛋白通過(guò)激活PI3K-AKT通路并使AKT通路處于活躍狀態(tài)，誘導(dǎo)了細(xì)胞的永生化并逃避免疫監(jiān)視，是致癌的關(guān)鍵通路，而且該研究表明，腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)AKT2能降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥[15]。

3上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移

MMPs是鋅依賴性蛋白酶家族之一，其通過(guò)破壞細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。目前MMPs家族的26個(gè)成員中，MMP-2和MMP-9多與患者預(yù)后不良相關(guān)。腫瘤細(xì)胞在致癌基因激活后合成MMP，從而使抑癌蛋白失活，刺激生長(zhǎng)因子或炎癥介質(zhì)的生成以及活性氧的產(chǎn)生和/或缺氧的存在，它們作用于細(xì)胞表面分子，影響細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）之間的粘附（如鈣粘蛋白或整聯(lián)蛋白），從而使腫瘤細(xì)胞與相鄰細(xì)胞和ECM分離，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。其次，MMPs降解基底膜和ECM，為癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和組織侵襲做準(zhǔn)備[16]。而且研究發(fā)現(xiàn)MMPs允許癌細(xì)胞到達(dá)局部血液或淋巴管并穿透其壁，進(jìn)而導(dǎo)致血行轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移，在小血管腔中，癌細(xì)胞通過(guò)MMP動(dòng)作進(jìn)入血管壁，并且在逃脫免疫監(jiān)視的情況下，產(chǎn)生繼發(fā)性腫瘤[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP成員中的MMP-9，MMP-2和MT1-MMP在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，它們的RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)在正常子宮頸和低級(jí)CIN中極低或不存在，在高級(jí)CIN及宮頸癌患者中表達(dá)量很高，此外，這些MMP的表達(dá)與高級(jí)CIN及宮頸癌患者中腫瘤血管密度成正相關(guān)[18]。MMPS在宮頸病變過(guò)程中離不開E6或E7蛋白的調(diào)節(jié)，在正常或轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞中，致癌的E6或E7蛋白下調(diào)TIMP和/或上調(diào)MMP-2，MMP-9或MT1-MMP表達(dá)，從而增加上皮細(xì)胞的侵襲力，因此，宮頸癌患者血漿中MMP-9、MMP-2或MT1-MMP的含量與預(yù)后不良和腫瘤分期較高相關(guān)[19]，而這些現(xiàn)象與E6和E7蛋白對(duì)絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT通路的激活有一定的相關(guān)性[20]。綜上所述，磷酸化的AKT可以促進(jìn)MMPs基因表達(dá)，即E6和E7蛋白激活A(yù)KT通路使其磷酸化，又進(jìn)一步促進(jìn)了MMPs基因的表達(dá)，增加了腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。

4通過(guò)白細(xì)胞介素-18（IL-18）逃避免疫監(jiān)視

IL-18是一種中性粒細(xì)胞趨化因子，由單核細(xì)胞產(chǎn)生，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞增生及ECM的生成。細(xì)胞免疫是抗腫瘤的主要免疫方式，IL-18通過(guò)刺激Thl和Th2細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)NK細(xì)胞和Thl細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，因此在抗腫瘤的免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，Thl和Th2的比例失衡與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[21]。為了進(jìn)一步證明E6及E7基因?qū)L-18的作用，Cho等[22]通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法使HaCAT（正常角質(zhì)形成細(xì)胞系）和C-33A（HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系）穩(wěn)定表達(dá)E6、E7蛋白，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)各細(xì)胞系中IL-18的表達(dá)，結(jié)果顯示，E6的表達(dá)與IL-18的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在表達(dá)E6基因的C-33A細(xì)胞系中p53基因表達(dá)顯著下降，而E7在兩細(xì)胞系中均未顯著影響IL-18的表達(dá)。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，E6癌基因不直接抑制IL-18啟動(dòng)子P1和P2的活性，而是通過(guò)間接途徑抑制IL-18表達(dá)，并抑制IL-18受體活化后的下游聯(lián)級(jí)效應(yīng)，使機(jī)體不能及時(shí)通過(guò)細(xì)胞免疫消滅病變細(xì)胞，導(dǎo)致突變細(xì)胞的增殖、擴(kuò)散。另外研究發(fā)現(xiàn)，IL-18具有誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素-γ2的功能，干擾素-γ2具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤的特性，當(dāng)機(jī)體持續(xù)感染HPV時(shí)，E6、E7蛋白通過(guò)間接抑制干擾素-γ2的產(chǎn)生來(lái)逃避免疫監(jiān)視，加快腫瘤的形成[23]。

5小結(jié)

綜上所述，HPV E6/E7可通過(guò)多種途徑導(dǎo)致宮頸癌，這些途徑之間并不是獨(dú)立的，而是相互作用共同導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)，宮頸涂片作為宮頸癌的初步篩查方法，為廣大女性贏得了及時(shí)診治的機(jī)會(huì)，但宮頸細(xì)胞學(xué)的局限性和較高的假陽(yáng)性率是開發(fā)新預(yù)防方法的充分理由[24]，且目前宮頸癌的治療方式仍以手術(shù)治療為主，術(shù)前的新輔助化療及術(shù)后化療仍不能有效預(yù)防宮頸癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[25]。目前，已有大量研究開始從致癌機(jī)理上尋找突破口，探索預(yù)防和治療惡性腫瘤的新靶點(diǎn)，如DNA疫苗、基因治療及創(chuàng)新的RNA干擾技術(shù)（RNAi）等。RNAi是通過(guò)降解轉(zhuǎn)錄后mRNA或抑制其翻譯成蛋白質(zhì)來(lái)阻斷目的基因的表達(dá)，沉默目的基因的表達(dá)是目前實(shí)驗(yàn)較常用的實(shí)驗(yàn)方法，該技術(shù)能否為今后的基因靶向治療提供有效的幫助仍需進(jìn)一步探索。上文提到，DNA甲基化是癌基因表達(dá)最重要的表觀遺傳機(jī)制之一，這些表觀遺傳修飾涉及腫瘤進(jìn)展，并且可能在某種程度上可用于未來(lái)的診斷[26]。另外，用DNMT抑制劑處理細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致被抑制的基因重新表達(dá)并增加細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，希望通過(guò)進(jìn)一步研究可以將這一機(jī)理應(yīng)用到預(yù)防宮頸癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的治療中[27]。近年來(lái)，PI3K-AKT抑制劑也成為宮頸癌治療研究的熱點(diǎn)，尤其是HPV感染患者，有研究發(fā)現(xiàn)AKT抑制劑在常氧條件下抑制HPV陽(yáng)性癌細(xì)胞的增殖，結(jié)果表明，AKT抑制劑的抗增殖作用優(yōu)于來(lái)自E6/E7的促生長(zhǎng)刺激作用[28]。另外，PI3K/AKT抑制劑具有免疫調(diào)節(jié)特性，其可通過(guò)降低免疫抑制細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)以及抑制免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞（如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或髓源抑制因子）的效應(yīng)功能來(lái)增強(qiáng)腫瘤免疫監(jiān)視[29]。由于HPV陽(yáng)性癌細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)依賴于病毒癌基因的連續(xù)表達(dá)，因此要更加深入地研究E6/E7基因的致癌機(jī)制，爭(zhēng)取找到預(yù)防和治療宮頸癌及其他相關(guān)惡性腫瘤的有效靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2019-12-16? 本文編輯：任秀蘭）