周際海 程 坤 郜茹茹 段洪浪 濮海燕 金志農(nóng)

(1.南昌工程學(xué)院 江西省退化生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)與流域生態(tài)水文重點實驗室 南昌 330099； 2.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 重要生物資源保護與利用研究安徽省省級重點實驗室 蕪湖 241000)

隨著工農(nóng)業(yè)集約化發(fā)展，大量重金屬污染物通過污水灌溉、農(nóng)藥化肥施用、礦產(chǎn)資源開采等方式進入土壤，影響著人類和動植物的生存環(huán)境，其中鎘(Cd)污染問題尤為突出(曾星等, 2019)。鎘易被植物根系吸收，因此較高濃度鎘污染對植物體的生長會產(chǎn)生不良影響，主要表現(xiàn)為植物體光合作用降低、葉綠素含量減少、生物量下降、氣孔關(guān)閉、葉片萎縮、甚至出現(xiàn)死亡等現(xiàn)象(趙秀峰等, 2017; 呂波等, 2018; Zhangetal., 2003; Sandersonetal., 2019)。土壤中鎘等重金屬不僅限制植物正常生長，還可通過食物鏈進入人體，危害人體健康，20世紀60年代發(fā)生的日本“痛痛病”事件就是典型的鎘中毒事件。

土壤重金屬污染修復(fù)的方法有多種，其中植物修復(fù)因投資成本低、無二次污染等諸多優(yōu)點受到重視。植物修復(fù)是利用植物固定、吸收或提取土壤中的重金屬，以達到降低其生物有效性或去除污染物的效果(陳順鈺等, 2019)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多草本植物，如天藍遏蘭菜(Thlaspicaerulescens)(Bakeretal., 1994)、東南景天(Sedumalfredii)(朱凰榕等, 2019)、三葉鬼針草(Bidenspilosa)(劉沙沙等, 2018)、龍葵(Solanumnigrum)(Yuetal., 2015)和蜈蚣草(Pterisvittata)(楊樹深等, 2017)等對Cd具有超富集作用。

香樟(Cinnamomumcamphora)是我國南方主要園林與經(jīng)濟樹種，主要用于園林綠化與精油提取等，有較高經(jīng)濟價值。目前，有研究表明香樟對重金屬污染物具有一定富集能力(Hoetal., 2014; Zhanetal., 2011)，而關(guān)于重金屬污染土壤中香樟生理生化特征變化的研究卻鮮有報道。將香樟用于重金屬污染土壤的修復(fù)，既可以治理重金屬污染，又可提取精油，獲得環(huán)境和經(jīng)濟雙重效益。本研究選取1年生香樟作為供試植物，研究鎘對香樟的凈光合速率、葉綠素等生理生化特性的影響，為科學(xué)評估香樟用于鎘污染土壤的生態(tài)恢復(fù)提供初步的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 0～20 cm土層鮮土采自進賢縣江西省紅壤研究所。剔除石塊及根茬等，自然風干，過2 mm篩后供盆栽用。土壤基本理化性質(zhì)為： 有機質(zhì)7.24 g·kg-1，全氮1.58 g·kg-1，全磷0.96 g·kg-1，有效磷128.57 mg·kg-1，總鎘0.26 mg·kg-1，pH4.35，飽和含水量42.3%。1年生香樟由南昌工程學(xué)院香樟種質(zhì)資源圃提供，株高28 cm，基徑4.12 mm，每株保留3個側(cè)枝。

1.2 試驗設(shè)計 采用室內(nèi)盆栽試驗，依據(jù)中國《土壤環(huán)境質(zhì)量標準》(GB15618—1995)，將鎘污染濃度分別設(shè)置為0(CK)、1 mg·kg-1(Cd1，一級標準值的5倍)、10 mg·kg-1(Cd2，一級標準值的50倍)、30 mg·kg-1(Cd3，一級標準值的150倍)，每個處理設(shè)5個重復(fù)。精確配置2 000 mg·L-1的含Cd2+溶液作為母液，依試驗設(shè)計，從盆栽底部均勻澆灌于盆中，使土壤鎘濃度分別達到相應(yīng)脅迫濃度，栽種1年生香樟幼苗。按農(nóng)田常規(guī)施肥量N 300 kg·hm-2、P 150 kg·hm-2，將水溶性肥料(N ≥ 30 g·L-1、P2O5≥ 14 g·L-1)稀釋后作基肥每盆施用40 mL。盆栽置于光照試驗臺上，盆的大小為直徑15 cm、高24 cm，每盆裝土2.5 kg。每周更換盆栽位置，每天稱量并澆入去離子水，使盆栽土壤含水量保持在飽和含水量的50%。培養(yǎng)期間光照與黑暗各12 h·d-1(開、關(guān)燈時間為7:00、19:00，光照強度200 μmol·m-2s-1)，控制室內(nèi)溫度為25～30 ℃，分別于第0、15、30、60天時，采樣測定香樟葉片光合作用參數(shù)、葉綠素等生理生化指標。

1.3 測定方法 光合作用參數(shù)： 采用帶有紅藍光源的Li-6400XT型便攜式光合測量系統(tǒng)，于采樣當天上午9： 00—11： 00，測定距離頂端的第5片葉在飽和光強下的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)等； 測定的飽和光強為1 200 μmol·m-2s-1，流速為500 mL·min-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1，葉室溫度為28 ℃。葉綠素(Chl)含量測定采用95%乙醇浸提法； 脯氨酸(Pro)含量測定采用酸性茚三酮比色法； 可溶性蛋白含量采用測定考馬斯亮藍G-250比色法； 可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法； 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑比色法； 過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法； 丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法(李合生, 1999)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013進行統(tǒng)計，利用SPSS 19.0進行單因素(One-way ANOVA)方差分析，Origin 9.5進行非線性回歸分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘對香樟葉片光合作用參數(shù)的動態(tài)影響 由圖1可知，香樟葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)和瞬時水分利用效率(WUEi)隨著鎘脅迫時間的增加，各鎘濃度處理的氣體交換參數(shù)均呈下降趨勢，且脅迫后期(30和60天)高濃度鎘處理(Cd3)對凈光合速率影響較顯著。第15天時， Cd1的Pn、Gs、Ci和Tr比對照CK分別增加約4.25%、35.78%、34.71%和24.15%，Cd2的分別增加約4.59%、40.37%、50.04%和11.78%，而Cd3的各項參數(shù)(凈光合速率除外)均低于CK。第30天時，不同鎘濃度的Pn顯著降低，且隨鎘濃度增加逐漸下降，與CK相比，Cd1、Cd2和Cd3的Pn分別下降11.74%、10.48%和20.35%(P<0.05)； 不同鎘濃度的Gs較CK平均顯著降低約21.23%，而不同鎘濃度處理間差異不顯著； 不同濃度鎘處理的Ci均顯著低于CK(P<0.05)，其中Cd1的Ci最小，降低約12.56%； 不同鎘濃度處理均可降低香樟葉片的瞬時水分利用效率WUEi，而增加其氣孔限制值Ls。第60天時，不同鎘濃度的Pn較CK均有不同程度降低，其中Cd3的Pn顯著低于CK約24.32%(P<0.05)； Cd1、Cd2和Cd3的Ci分別較CK顯著增加約33.49%、41.01%和36.40%(P<0.05)； Cd1和Cd2的Tr分別較CK顯著增加約33.48%和54.60%(P<0.05)； 而各濃度鎘處理的WUEi和Ls均低于CK，其中Cd2的最低，分別降低約41.13%和28.47%。整個培養(yǎng)期內(nèi)各濃度鎘處理的Pn、Gs均有下降趨勢，但對香樟生長無明顯影響。以上結(jié)果表明，鎘脅迫對香樟光合作用各參數(shù)都有一定程度的影響，但香樟對本研究中的鎘脅迫均有一定耐性。

圖1 不同鎘濃度對香樟葉片光合作用參數(shù)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of cadmium on the photosynthetic characteristics parameters

由圖2可知，各處理的凈光合速率和氣孔導(dǎo)度間呈非線性關(guān)系(y=k·ln(x) +yasym,asym代表氣孔導(dǎo)度趨向1時的增大凈光合速率)，凈光合速率隨氣孔導(dǎo)度增加而增加，但存在閾值。由表1可知，曲線回歸系數(shù)R2、k和yasym的相關(guān)關(guān)系，不同處理間的凈光合速率和氣孔導(dǎo)度無顯著相關(guān)關(guān)系，說明本研究香樟的光合參數(shù)變化主要與鎘脅迫有關(guān)。

圖2 凈光合速率與氣孔導(dǎo)度關(guān)系Fig.2 The relationship between net photosynthetic rate and stomatal conductance

表1 凈光合速率與氣孔導(dǎo)度間關(guān)系特征①Tab.1 Nonlinear regression parameters between net photosynthetic rate and stomatal conductance

2.2 鎘對香樟葉綠素含量的影響 由圖3可知，隨著鎘脅迫時間及濃度增加，各類色素和葉綠素a/b并不呈單一的上升或下降趨勢。第15天時，Cd1和Cd3的葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總量較CK最高分別顯著降低約29.96%、33.19%和25.76%，而Cd2的各色素差異不顯著。第30天時，鎘脅迫下的葉綠素a和總?cè)~綠素含量較CK分別顯著降低26.46%和16.72%(P<0.05)； 與CK相比，Cd1和Cd2的葉綠素b含量分別降低11.70%和18.72%，而Cd3的顯著增加47.65%(P<0.05)； Cd3的葉綠素a/b顯著低于CK約60.74%，而其他各處理間無顯著差異。第60天時，與CK相比，不同濃度鎘處理的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均不同程度下降，其中Cd3的各類色素含量最低，其葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量分別較CK顯著降低31.04%、38.10%和33.37%(P<0.05)； 鎘脅迫處理對葉綠素a/b無顯著影響。以上結(jié)果表明，鎘脅迫可以影響香樟葉片葉綠素等色素的合成，進而對光合作用產(chǎn)生一定的影響。

圖3 不同濃度鎘對香樟葉片葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of cadmium contaminated on chlorophyll content of C. camphora leaves

2.3 鎘對香樟葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 隨著鎘脅迫時間的增加，不同鎘濃度處理的脯氨酸含量呈先下降后上升再下降的趨勢(表2)。第15天時，Cd1、Cd2和Cd3的脯氨酸含量分別比CK高36.57%、11.41%和65.10%，除Cd2與CK差異不顯著外，其他處理間差異顯著(P<0.05)。第30天時，Cd1、Cd2和Cd3的脯氨酸含量分別比CK高8.42%、41.23%和54.38%，除Cd1與CK差異不顯著外，其他處理間差異顯著(P<0.05)。第60天時，Cd3的脯氨酸含量最高，比CK高14.85%(P<0.05)，而其他處理與CK間均無顯著差異。隨著鎘脅迫時間的增加，不同濃度鎘處理的可溶性糖含量呈上升趨勢，且不同處理間存在一定差異(表2)。在整個培養(yǎng)期內(nèi)，Cd3的可溶性糖含量高于其他處理，比CK高43.74%(P<0.05)。第15天時，除Cd2的可溶性糖含量與CK無顯著差異外，其他處理間均有顯著差異(P<0.05)。第60天時，Cd1、Cd2和Cd3的可溶性糖含量分別高于CK約26.61%、29.73%和30.27%(P<0.05)，其他處理間無顯著差異。隨著鎘脅迫時間的增加，不同濃度鎘處理的可溶性蛋白含量呈先下降后上升趨勢(表2)。在整個培養(yǎng)期內(nèi)，Cd2和Cd3的可溶性蛋白含量顯著高于Cd1和CK(P<0.05)，且Cd2和Cd3間差異不顯著。第15天和30天時，Cd2和Cd3的可溶性蛋白含量最高分別高于CK約65.43%和73.15%(P<0.05)。以上結(jié)果表明，香樟可以通過調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成來適應(yīng)鎘脅迫環(huán)境。

表2 不同濃度鎘對香樟葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Tab.2 Effects of different concentrations of cadmium on the osmotica of C. camphora leaves

2.4 鎘對香樟葉片超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性和丙二醛的影響 由圖4A可知，隨著鎘脅迫時間的增加，超氧化物歧化酶(SOD)活性總體呈下降趨勢。第15天時，Cd1、Cd2和Cd3的SOD活性顯著低于CK(P<0.05)。第30天時，Cd2和Cd3的SOD活性分別高于CK約26.19%和18.53%(P<0.05)，而Cd1的則低于CK約4.07%，Cd3與其他處理間差異不顯著。第60天時，Cd2和Cd3的SOD活性分別高于CK約21.31%、13.48%(P<0.05)，CK與Cd1、Cd2與Cd3間的SOD活性無顯著差異。由圖4B可知，隨著鎘脅迫時間的增加，過氧化物酶(POD)活性總體呈上升趨勢，且不同處理的SOD活性均表現(xiàn)為Cd3> Cd2> Cd1> CK。第15天時，Cd1、Cd2和Cd3的POD活性分別高于CK約18.33%、28.09%和65.13%(P<0.05)，各處理間差異顯著。第30天時，Cd1、Cd2和Cd3的POD活性分別高于CK約16.49%、39.18%和44.33%(P<0.05)。第60天時，Cd1、Cd2和Cd3的POD活性分別高于CK約24.94%、29.20%和48.60%(P<0.05)。由圖4C可知，整個培養(yǎng)期內(nèi)Cd2的丙二醛(MDA)含量最高，而CK最低。第15天時，Cd2和Cd3的MDA含量分別高于CK約21.36%和16.94%(P<0.05)，但各處理間無顯著差異。第30天時，Cd2的MDA含量高于CK約24.21%(P<0.05)，其他處理間無顯著差異。第60天時，Cd2和Cd3的MDA含量分別高于CK約41.75%和34.38%(P<0.05)。以上結(jié)果表明香樟可以通過調(diào)控抗氧化系統(tǒng)來適應(yīng)鎘脅迫環(huán)境。

圖4 不同濃度鎘對香樟葉片超氧化物歧化酶 (A)、過氧化物酶活性 (B) 和丙二醛 (C) 的影響Fig.4 Effects of different concentrations of cadmium on the activities of SOD (A)， POD (B) and MDA content (C) in C. camphora leaves

3 討論

3.1 光合作用參數(shù)對鎘脅迫的響應(yīng) 光合作用與生產(chǎn)力和產(chǎn)量等密切相關(guān)(Zhouetal., 2019)。Cd脅迫可通過影響與光合有關(guān)的元素吸收與同化、改變色素含量、干擾葉片氣孔開閉行為、影響電子傳遞等，進而影響植物的光合速率，使植物失綠、黃葉、生長減緩。簡敏菲等(2015)研究表明，Cd脅迫下光合氣體交換參數(shù)(Pn、Gs、Tr和WUEi)隨著脅迫時間及Cd濃度的增加表現(xiàn)出下降趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)短時間(15天)鎘脅迫對香樟葉片的Pn、Gs和Ci無顯著影響，而長時間(30和60天)鎘脅迫下的Pn較CK均有不同程度的下降，其中最高濃度鎘處理Cd3的凈光合速率下降最明顯，表明高濃度鎘對香樟光合能力的抑制作用更為強烈。凈光合速率(Pn)下降主要可分為氣孔限制和非氣孔限制2種(Adeletal., 2005)，而Ci值的高低可作為判斷氣孔限制和非氣孔限制的主要參考依據(jù)，Pn、Gs和Ci同時下降可能是氣孔限制；Pn、Gs下降，Ci增加則表明可能是非氣孔限制所致(祁金洋等, 2018)。本研究Pn隨著Gs的增加呈非線性增加且存在閾值，而不同濃度鎘處理的Pn和Gs間關(guān)系無顯著差異。香樟葉片的Pn在鎘脅迫后期隨鎘濃度的增加而降低，這可能是香樟葉綠素含量下降，也可能是因為鎘脅迫引起香樟脫落酸含量增加(Kazninaetal., 2014)，迫使Gs下降，導(dǎo)致光合作用受到抑制，進而影響Pn和Gs，使其隨培養(yǎng)時間及鎘濃度的增加逐漸降低。

3.2 鎘脅迫對葉綠素合成的影響 葉綠素是植物葉片進行光吸收、光傳遞和光轉(zhuǎn)化的場所，在一定程度上是反映植物光合能力受環(huán)境脅迫程度的重要指標(王怡霖等, 2019)。不同濃度鎘處理下香樟葉綠素含量均有不同程度的降低，這與楊葉萍等(2016)研究結(jié)果相似?？赡苁窍阏猎阪k脅迫環(huán)境中，吸收了較多Cd2+進入香樟細胞組織內(nèi)，與葉綠體蛋白質(zhì)上的羥基配位螯合或與其中的鐵、鎂等離子發(fā)生置換，使葉綠體的形態(tài)和基粒結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，葉綠體功能紊亂，生理機制平衡逐漸被抑制作用代替(Adeletal., 2005)，導(dǎo)致葉綠素含量下降。培養(yǎng)期內(nèi)，Cd1處理的葉綠素含量雖低于對照，但隨著鎘脅迫時間的增加有逐漸增加趨勢，可能是低濃度鎘對香樟葉綠素合成的影響程度較弱，香樟逐漸對鎘脅迫產(chǎn)生一定的適應(yīng)性，香樟可通過消耗更多能量或與其他抗氧化酶協(xié)同維持機體內(nèi)的生理代謝平衡。在較長時間高濃度鎘脅迫下會導(dǎo)致香樟光合色素及光合作用下降，但是香樟通過調(diào)控Pn和Gs等生理特性以適應(yīng)或降低鎘脅迫的影響，增強自我調(diào)節(jié)機制。

3.3 鎘脅迫對香樟葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)控 植物受重金屬脅迫時，其生理生化特性可反映植物的應(yīng)對機制。脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白作為植物細胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其累積與植物體內(nèi)過量活性氧自由基的清除及膜脂過氧化傷害的減輕密切相關(guān)(張麗萍等, 2016; Batooletal., 2014; Sinishaetal., 2018)，在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，無論高還是低濃度的鎘脅迫，香樟幼苗葉片的脯氨酸、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均有一定程度增加，且高濃度鎘處理Cd3的各物質(zhì)含量最高，這與Ali等(2014)研究植物體內(nèi)可溶性蛋白含量會隨鎘濃度增加而降低不同，可能與不同鎘濃度的變化有關(guān)。各調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的提高可能是在鎘脅迫下香樟葉片通過自身的調(diào)控機制，如螯合、區(qū)化等作用產(chǎn)生更多的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白，保持細胞原生質(zhì)滲透勢和膨壓，緩解逆境脅迫造成的植株細胞脫水或水分代謝異常，以維持植株的正常生長發(fā)育。陳良華等(2017)研究認為，10 mg·kg-1鎘處理下脯氨酸含量增加，有利于平衡美洲黑楊(Populusdeltoides)雌、雄株葉肉細胞內(nèi)的滲透勢，減緩葉肉細胞受到的氧化危害。此外，陸秀君等(2008)研究也發(fā)現(xiàn)，長時間鎘脅迫可誘導(dǎo)刺槐(Robiniapseudoacacia)葉片大量形成脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白，以提高植物的抗逆性。

3.4 鎘脅迫對香樟葉片抗氧化系統(tǒng)的影響 SOD是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)中重要的保護酶之一，有助于將氧自由基團轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，減輕自由基對植物體細胞的毒害(胡國濤等, 2016; 楊波等, 2018; Yilmazetal., 2018)。本研究結(jié)果表明，鎘脅迫前期(15天)，不同濃度鎘處理的SOD活性低于CK，而在鎘脅迫后期，中高濃度鎘處理的SOD活性高于低濃度鎘處理和CK，由此認為較長時間高濃度鎘脅迫會誘導(dǎo)香樟提高SOD活性來清除自由基，以維持香樟正常生長機能。這與湯葉濤等(2010)研究發(fā)現(xiàn)滇苦菜(Picrisdivaricata)SOD活性隨著鎘濃度的增加而提高有類似之處。POD具有去除過氧化氫和酚類等毒性物質(zhì)的重要功能(張軍等, 2018)。POD活性隨著鎘脅迫時間及鎘濃度的增加而增加，可能是受鎘脅迫后，更多的鎘離子進入香樟組織，使其組織內(nèi)有毒害作用的H2O2不斷累積增加，從而誘導(dǎo)植物體POD活性增加，以抵御外界不良環(huán)境。MDA是植物細胞膜脂過氧化物，其含量的高低反映了植物細胞膜結(jié)構(gòu)受損傷的程度(Lluganyetal., 2013)。本研究結(jié)果表明，在整個鎘脅迫期內(nèi)，中高濃度鎘處理(Cd2和Cd3)的MDA含量高于CK，在脅迫60天時影響最為顯著，這與Stoláriková-Vaculíková等(2015)研究結(jié)果相似。長時間高濃度鎘脅迫對香樟葉片細胞膜系統(tǒng)具有損害作用，而香樟會通過調(diào)節(jié)體內(nèi)SOD和POD活性來消除毒害物質(zhì)，是香樟耐鎘的主要機制之一。關(guān)于高濃度鎘脅迫機制及調(diào)節(jié)物質(zhì)的應(yīng)答機制還有待深入研究。

本研究結(jié)果表明，在一定濃度的鎘污染土壤中，香樟可通過調(diào)控光合作用、抗氧化保護酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等生理生化過程適應(yīng)鎘污染環(huán)境，維持其正常生長。但本研究僅開展了短期(60天)鎘脅迫下香樟的生理生化特性研究，可能是一些短期現(xiàn)象，更長時間鎘脅迫對香樟的生理生化影響是否相似，有待后期長期深入監(jiān)測研究，以期為香樟用于重金屬污染場地的生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

香樟葉片的凈光合速率、葉綠素、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶系統(tǒng)和MDA等生理生化特征對不同濃度鎘的響應(yīng)存在一定差異。短時間內(nèi)各濃度鎘處理香樟葉片的凈光合速率(Pn)無明顯變化，較長時間鎘脅迫會導(dǎo)致Pn降低，且鎘濃度越高，葉片的Pn越低。鎘脅迫會導(dǎo)致香樟的葉綠素含量出現(xiàn)不同程度的降低，而使香樟葉片的脯氨酸、可溶性糖含量增加，且以高濃度鎘處理Cd3最高。培養(yǎng)后期(30和60天)，SOD和POD活性顯著上升，可減輕逆境對香樟葉片膜系統(tǒng)造成的損傷。香樟在重金屬鎘脅迫下能保持較好生長，因此香樟對鎘具有較強耐性，具備修復(fù)重金屬污染土壤的潛力。