任興權(quán)，蘇菊，蘇阿龍王蓉，劉盼*

1(酒泉市食品檢驗檢測中心，甘肅 酒泉， 735000)2(甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州，730000)

馬鈴薯是當(dāng)今世界第四大糧食作物，在貯藏中，受光照、溫度等因素的影響，馬鈴薯易變綠或發(fā)芽，在這一過程中產(chǎn)生了以茄啶為糖苷配基構(gòu)成的一類生物堿[1]，俗稱為龍葵素，其成分為α-茄堿、β-茄堿、γ-茄堿、α-卡茄堿、β-卡茄堿、γ-卡茄堿，其中α-茄堿和α-卡茄堿的含量占總的糖苷生物堿的95%。龍葵素有較強(qiáng)的毒性[2-15]，當(dāng)一次攝入量超過200 mg時就會引起急性中毒，攝入量更高時就會導(dǎo)致舌頭發(fā)麻、腹瀉、嘔吐、發(fā)熱、頭痛、血壓下降，甚至耳鳴、昏迷、抽搐、瞳孔放大，呼吸中樞麻痹而死亡。長期食用龍葵素含量較高的馬鈴薯還會致畸和脊柱裂?？茖W(xué)、準(zhǔn)確地分析馬鈴薯中的α-茄堿、α-卡茄堿的含量關(guān)聯(lián)著每一個人的身體健康。

目前已報道的馬鈴薯中主要糖苷生物堿α-茄堿、α-卡茄堿的分析監(jiān)測方法有比色法[16]、液相色譜法[17-28]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[29-35]，后2種方法研究得比較多。邵慧凱等[17]用異丁醇萃取馬鈴薯中的α-茄堿，在210 nm波長處檢測。趙丹青等[18]用乙醇-乙酸溶液提取茄堿后過SPE NH2小柱，用甲醇-二氯甲烷洗脫，液相色譜檢測。張舵[23]用無水乙醇-乙酸溶液提取后液相色譜檢測。王建鳳等[29]用V(1%甲酸)∶V(乙醇)=1∶1提取，采用液相-質(zhì)譜法檢測。劉紅河等[30]用V(甲酸)∶V(乙醇)=1∶1作為溶劑提取，并且用MCX固相萃取柱萃取后用高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測馬鈴薯及制品中α-茄堿。戴超等[32]用V(乙酸)∶V(乙醇)=1∶10混合溶劑振蕩提取后運用液質(zhì)聯(lián)法分析貯藏對馬鈴薯中α-茄堿含量的影響。張春嬌等[33]采用10%乙酸提取后并且經(jīng)C18SPE小柱凈化后用液-質(zhì)法檢測?，F(xiàn)有的液相色譜法和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法普遍存在的問題是前處理提取繁瑣、提取效果不理想，分析的色譜和質(zhì)譜條件沒有達(dá)到最佳。

本研究創(chuàng)新了前處理方法，樣品用酸化甲醇提取后，用無水硫酸鈉和無水乙酸鎂吸收水分后離心，以期改善提取效果優(yōu)化液相和質(zhì)譜條件，對馬鈴薯中主要糖苷生物堿α-茄堿和α-卡茄堿進(jìn)行高效快捷的分析和監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯，市購。

甲醇、乙腈(均為色譜純)，默克股份兩合公司；甲酸(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鈉、無水乙酸鎂、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、乙酸、乙醇、異丁醇(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4、甲酸銨、乙酸銨(均為色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；α-茄堿(C45H73NO15，CAS號：20562-02-1，純度≥99.9%)，多倫多研究化學(xué)公司;α-卡茄堿(C45H73NO14，CAS號：20562-03-2，純度≥99.9%)，ChromaDex公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6460電噴霧-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；艾柯Advanced-Ⅱ-12型高純水機(jī)，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；寧波新芝SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；長沙英泰TG16型離心機(jī)，長沙英泰儀器有限公司；IKA MS3型渦旋混合器，IKA公司；賽多利斯SQP型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；梅特勒PL602E/02便攜式天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 液相色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);流動相A為1 mmol/L酸化甲酸銨溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫0.0～4.0 min,90%A; 4.0～5.0 min,10%A; 5.0～7.0 min,90%A。流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離正離子模式，電噴霧電壓4 000 V,離子源溫度350 ℃，霧化器壓力20 psi。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制

分別稱取10 mg α-茄堿和α-卡茄堿于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；用甲醇逐級稀釋成1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.4 樣品預(yù)處理

用均質(zhì)器將樣品充分打碎混勻，放入分裝容器中，密封并標(biāo)記，于-20 ℃以下冷凍存放。

稱取試樣1.0 g(精確至0.001 g)于50 mL具塞離心管中，加入3.0 mL水渦旋混勻1 min，再準(zhǔn)確加入25.0 mL酸化甲醇(1%甲酸+99%甲醇)，渦旋1 min。之后，向離心管中加入2.0 g 無水硫酸鈉，1.0 g 無水乙酸鎂。手動劇烈搖動1 min后渦旋1 min。再將離心管置于離心機(jī)中，在室溫條件下以10 000 r/min的速度，離心5 min。取50 μL上清液于10 mL容量瓶中，加入甲醇水溶液(40%甲醇)定容至刻度，過微孔濾膜(0.22 μm，尼龍)后上機(jī)測定。

1.3.5 定性、定量方法

以α-茄堿和α-卡茄堿保留時間定性，以外標(biāo)法對α-茄堿和α-卡茄堿進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的選擇

馬鈴薯中α-茄堿、α-卡茄堿的文獻(xiàn)報道提取方法主要有乙酸水溶液法、乙醇法、乙醇-乙酸混合劑法、異丁醇萃取法、乙酸-乙腈、乙醇-乙腈等，通過實驗驗證均能不同程度的提取，可是提取效果均不理想，達(dá)不到完全提取。本研究先加入少量水溶后再用酸化甲醇提取，加入無水硫酸鈉、無水乙酸鎂吸收多余的水，最后在高速離心機(jī)上離心。通過對不同方法的試驗對比得出酸化甲醇能夠最大限度的提取茄堿，無水硫酸鈉、無水乙酸鎂有很強(qiáng)的吸水性。在酸性、含水量少的環(huán)境中α-茄堿、α-卡茄堿易溶于甲醇，酸化甲醇、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉同時作用為α-茄堿、α-卡茄堿的提取創(chuàng)造了最佳的環(huán)境。對一樣品均質(zhì)后等量稱取7份分別用本方法及文獻(xiàn)報道效果較好的方法處理提取后分析，測定2次的平均含量情況，如圖1所示。由圖1可以看出本法的前處理方法比文獻(xiàn)報道的前處理方法提取效果更好。

圖1 不同前處理試劑的提取效果圖Fig.1 Extraction effect of different pretreatment reagents

2.2 儀器條件的選擇

2.2.1 質(zhì)譜條件的選擇

在正離子模式下，對α-茄堿、α-卡茄堿進(jìn)行母離子和子離子掃描，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 α-茄堿和α-卡茄堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters of α-solanine and α-chaconine

2.2.2 色譜柱的選擇

對Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)與OmniBond HPLC Hubble C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Allure PFP Propyl C18(100 mm×2.1 mm,5 μm)4種色譜柱進(jìn)行了對比，α-茄堿和α-卡茄堿在Agilent Eclipse Plus C18色譜柱上分離效果最好，柱效高，選擇性高，pH穩(wěn)定性好，峰型對稱尖銳。

2.2.3 流動相體系的選擇

分別考察了檢測α-茄堿和α-卡茄堿的流動相體系乙腈-水、甲醇-水、1 mmol/L乙酸-乙酸銨溶液+甲醇、1 mmol/L甲酸-甲酸銨溶液+甲醇、1 mmol/L乙酸-乙酸銨溶液+乙腈、1 mmol/L甲酸-甲酸銨溶液+乙腈等流動相體系的對α-茄堿和α-卡茄堿的分離效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動相體系為1 mmol/L甲酸-甲酸銨溶液+乙腈時分離效果最佳。

2.2.4 流動相淋洗方式的選擇

對流動相采用等度淋洗和梯度淋洗時的效果進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)梯度淋洗的效果更好一些，設(shè)置不同梯度洗脫程序進(jìn)行效果驗證，當(dāng)梯度洗脫程序為0.0～4.0 min,90%A; 4.0～5.0 min,10%A; 5.0～7.0 min,90%A時，洗脫效果最優(yōu)。

2.2.5 流動相流速的選擇

分別對流速為0.10、0.20、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60 mL/min時的分離效果進(jìn)行了比對。結(jié)果表明，隨著流速的增大，保留時間縮短，α-茄堿和α-卡茄堿的保留時間越接近。綜合保留時間、響應(yīng)值、分離度等因素，流動相流速為0.4 mL/min時適宜。在此優(yōu)化的質(zhì)譜和液相條件下，α-茄堿和α-卡茄堿的標(biāo)準(zhǔn)譜圖見圖2和圖3，樣品中α-茄堿和α-卡茄堿的譜圖見圖4和圖5。

圖2 10.0 ng/mL α-茄堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of 10.0 ng/mL α-solanine standard solution

圖3 10.0 ng/mLα-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of 10.0 ng/mL α-chaconine standard solution

圖4 樣品中α-茄堿的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of α-solanine in sample

圖5 樣品中α-卡茄堿的MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatogram of α-chaconine in sample

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

分別以質(zhì)量濃度(X, ng/mL)為橫坐標(biāo)、響應(yīng)值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，α-茄堿和α-卡茄堿的線性方程及其相關(guān)系數(shù)見表2，可以看出在濃度為1.0～100 ng/mL時，2種茄堿的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 3～0.999 5，滿足定量分析的要求。

表2 α-茄堿和α-卡茄堿的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、及其方法檢出限Table 2 Linear equation, correlation coefficient (R2) and detection limit of α-solanine and α-chaconine

以不含茄堿的新鮮馬鈴薯肉作為空白基質(zhì)，在其中加入低濃度α-茄堿和α-卡茄堿，按照本研究的上述方法進(jìn)行前處理和分析檢測，以3倍、10倍信噪比計算得到本方法中α-茄堿和α-卡茄堿的檢出限均為0.3 mg/kg，定量限均為1.0 mg/kg。比對文獻(xiàn)報道的同類分析檢測的情況，本方法的靈敏度較高。

2.4 回收率和精密度

選用已分析α-茄堿和α-卡茄堿含量的馬鈴薯芽，分別添加10.0、50.0、100.0 ng/mL低、中、高3個濃度水平的α-茄堿和α-卡茄堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配成加標(biāo)樣品，按照上述方法進(jìn)行前處理，每個加標(biāo)水平的樣品平行分析6次，結(jié)果加標(biāo)回收率為98.9%～101.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%～1.41%，具體數(shù)據(jù)見表3，說明本方法有較高的準(zhǔn)確度和精密度，完全適合馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿的分析監(jiān)測。

表3 α-茄堿和α-卡茄堿的回收率和精密度Table 3 Recoeries and RSDs of α-solanine and α-chaconine

2.5 馬鈴薯樣品分析

用本方法對任意選取的馬鈴薯綠芽、綠皮、芽下肉、肉4種樣品中α-茄堿和α-卡茄堿總含量進(jìn)行分析檢測，結(jié)果馬鈴薯綠芽中的總含量為8 516 mg/kg, 馬鈴薯綠皮中的總含量為5 055 mg/kg, 馬鈴薯芽下肉中的總含量為830 mg/kg, 馬鈴薯肉中的總含量為166 mg/kg，從檢測結(jié)果可看出，馬鈴薯芽中的α-茄堿和α-卡茄堿含量是非常高的，從馬鈴薯綠芽、綠皮、芽下肉、肉依次降低。

2.6 與補(bǔ)充方法的對比

分別用本方法和補(bǔ)充方法土豆及其制品中α-茄堿和α-卡茄堿含量測定(BJS201806)對馬鈴薯的白芽、綠芽、綠芽加標(biāo)進(jìn)行前處理提取及分析，分析結(jié)果見表4，可以看出2種方法的檢測結(jié)果相對偏差在3.2%～11.2%，采用本方法提取及分析的含量明顯比補(bǔ)充方法提取及分析的含量高，同時在馬鈴薯綠芽添加10 ng/mL濃度水平的α-茄堿和α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)混合溶液后分析，通過分析結(jié)果得出本方法的加標(biāo)回收率為98.4%～102.8%，BJS201806補(bǔ)充方法的加標(biāo)回收率為81.6%～90.9%，進(jìn)一步證明了本方法不論是前處理提取還是分析條件都比補(bǔ)充方法更優(yōu)。

表4 本方法與補(bǔ)充方法檢測結(jié)果的對比Table 4 Comparison between the results of this method and the supplementary method

3 結(jié)論

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析監(jiān)測馬鈴薯中主要糖苷生物堿α-茄堿和α-卡茄堿的方法。利用酸化甲醇提取，用無水硫酸鈉和無水乙酸鎂吸收多余的水分后，在電噴霧正離子模式下，采用四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行分析檢測。與文獻(xiàn)報道的方法相比，本法操作簡單、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，完全滿足馬鈴薯及其制品中α-茄堿和α-卡茄堿的分析監(jiān)測，對于食用農(nóng)產(chǎn)品的安全監(jiān)管提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐，對保障公眾食品安全具有重要的社會意義。