董亞萍 楊仕梅 趙德剛 宋莉

摘 要： TIR-NBS基因是一類與植物抗病調(diào)節(jié)和生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的基因，其特征解析有助于對(duì)植物免疫和發(fā)育調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)。該研究通過(guò)生物信息學(xué)分析方法，從基因鑒定、染色體分布、基因結(jié)構(gòu)、蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位和順式作用元件等方面，對(duì)煙草TIR-NBS基因家族進(jìn)行了鑒定和分子特性分析。結(jié)果表明：煙草TIR-NBS基因家族含有30條成員，分布在21條染色體上，含有3～8個(gè)保守基序;編碼蛋白均為不穩(wěn)定蛋白，無(wú)信號(hào)肽，主要分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主要構(gòu)成元件;進(jìn)化時(shí)主要受純化選擇作用，與番茄的TIR-NBS基因親緣關(guān)系最近;順式作用元件分析表明其可能受光照、溫度以及生長(zhǎng)素、茉莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸、赤霉素等激素調(diào)控。該研究結(jié)果為進(jìn)一步探究TIR-NBS基因的生物學(xué)功能及提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 煙草， 抗病調(diào)節(jié)， 生長(zhǎng)發(fā)育， 植物免疫， TIR-NBS基因家族， 生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： Q943 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-3142（2020）06-0891-10

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID） ：

Abstract： TIR-NBS gene is a class of gene closely related to plant disease resistance regulation and growth and development， and its characteristic analysis contributes to the understanding of plant immunity and developmental regulation. Through bioinformatics analysis method， the TIR-NBS gene family of tobacco was identified and molecularly analyzed from the aspects of gene identification， chromosome distribution， gene structure， protein properties and structure， signal peptide， subcellular localization and cis-acting elements. The results were as follows： The TIR-NBS gene family contained 30 members， distributed on 21 chromosomes， containing 3-8 conserved motifs; The encoded proteins were unstable proteins， no signal peptides， mainly distributed in the nucleus， cytoplasm and chloroplast; The secondary structure was characterized by α-helix and random coiling; It was mainly selected by purification in evolution， and had the closest relationship with TIR-NBS gene of tomato; Analysis of cis-acting elements showed that it may be regulated by light， temperature， and hormones such as auxin， methyl jasmonate， abscisic acid， salicylic acid， and gibberellin. The results provided a basis for further exploring the biological functions of the TIR-NBS gene and improving plant yield and quality.

Key words： Nicotiana attenuata（tobacco）， disease resistance regulation， growth and development， plant immunity， TIR-NBS gene family， bioinformatics analysis

植物在長(zhǎng)期遭受真菌、細(xì)菌、病毒等各種病原體侵襲和危害過(guò)程中，逐漸形成保護(hù)自身的抗病免疫機(jī)制，由R抗病基因（resistance gene）介導(dǎo)的免疫反應(yīng)就是其中一條主要的途徑 （房衛(wèi)平等，2015;孫巖等，2017）。R基因由白細(xì)胞介素-1受體（toll and in-terleukin-1 receptor，TIR）結(jié)構(gòu)域、功能結(jié)構(gòu)域核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide bindingsite， NBS）、富含亮氨酸重復(fù)（leucine rich repeat， LRR）位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)組成。其中，TIR和NBS結(jié)構(gòu)與抗病調(diào)節(jié)相關(guān)（Meyers et al.， 2002），TIR-NBS類抗病基因作為一類重要的植物免疫基因，是R基因抗病免疫的重要基礎(chǔ)（Staal et al.， 2008;謝冬微等，2015） 。

TIR、NBS結(jié)構(gòu)域是抗病基因免疫反應(yīng)必需的。當(dāng)擬南芥的抗病基因RPS4或RPP1A在僅含TIR和NB結(jié)構(gòu)域的截短蛋白TIR+45或TIR+80片段時(shí)，即使沒(méi)有病原菌效應(yīng)蛋白的誘導(dǎo)也能引起細(xì)胞的壞死（Zhang et al.， 2004;尹玲等，2018）。煙草抗病毒N蛋白的免疫作用與其TIR結(jié)構(gòu)域進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)（Dinesh-Kumar et al.， 2000）。還有研究表明，TIR-NBS 類基因RLM3參與了擬南芥廣譜抗壞死致病真菌的免疫反應(yīng)過(guò)程（Staal et al.， 2008）。盡管TIR-NBS類蛋白在植物抗病過(guò)程中扮演著非常重要的角色，但人們對(duì)該基因家族及其成員的了解仍極為有限。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析方法，對(duì)煙草TIR-NBS基因家族的分子特征和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，為煙草TIR-NBS 類抗病基因的深入探究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TIR-NBS基因家族鑒定

在Pfam中下載NBS（NB-ARC）（http：//pfam.xfam.org/family/PF00931#tabview=tab6）和TIR（http：//pfam.xfam.org/family/PF01582#tabview=tab6）隱馬爾可夫模型。通過(guò) hmmsearch 程序用下載的 NB-ARC.hmm和TIR.hmm文件對(duì)煙草全基因組蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的含TIR-NBS結(jié)構(gòu)域的蛋白家族進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取的期望值E為1×10-20。

1.2 染色體定位分析

從Ensembl植物全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp：//ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-42/fasta/nicotiana_attenuata）獲得TIR-NBS基因在染色體上的位置信息，并用在線工具M(jìn)G2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）制作染色體定位圖。

1.3 基因結(jié)構(gòu)與motif分析

利用在線工具GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)煙草TIR-NBS基因家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。通過(guò)在線工具meme（http：//meme-suite.org/tools/meme）對(duì)煙草TIR-NBS蛋白motif進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.4 蛋白結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位分析

利用在線軟件SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）分析TIR-NBS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用在線工具SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)煙草TIR-NBS基因進(jìn)行信號(hào)肽分析。利用在線工具DeepLoc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）對(duì)煙草TIR-NBS基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.5 TIR-NBS蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy中的ProtParam （http：//web.expasy. org/protparam/）軟件對(duì)煙草TIR-NBS蛋白基本特性進(jìn)行分析， 包括蛋白質(zhì)大小、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、親水性指數(shù)和脂溶性指數(shù)等指標(biāo)。

1.6 進(jìn)化選擇壓力分析

利用Blast建庫(kù)比對(duì)和Calculator工具（Wang et al.， 2010），對(duì)煙草TIR-NBS基因核苷酸的同義替換率（Ks）和非同義替換率（Ka）進(jìn)行計(jì)算，獲得基因Ka/Ks比率，進(jìn)行選擇壓力分析。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

將檢索得到的煙草（Nicotiana attenuata）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）的TIR-NBS蛋白的氨基酸序列通過(guò)軟件Clustal X進(jìn)行TIR-NBS蛋白序列比對(duì)，然后利用MEGA-7.0 （Kumar et al.， 2016）軟件構(gòu)建TIR-NBS基因家族鄰接（NJ， neighbor-joining）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Boostrap值設(shè)置為1 000，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值，最后使用FigTree（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）軟件展示系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.8 順式作用元件分析

利用工具bedtools（Quinlan， 2014）獲得TIR-NBS基因上游2 000 bp序列，利用在線網(wǎng)站PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)獲得的序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)主要的順式作用元件進(jìn)行探討。

2 結(jié)果與分析

2.1 TIR-NBS基因家族成員

根據(jù)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中TIR-NBS基因家族主要含有NB-ARC、TIR-NB-ARC-LRR、TIR-NB-ARC功能域的特征，通過(guò)構(gòu)建隱馬爾可夫模型，設(shè)置E-value為1×10-20，共鑒定到217條基因，去掉不含有TIR-NB-ARC結(jié)構(gòu)的基因，最終獲得30條煙草TIR-NBS基因。

2.2 TIR-NBS基因家族的染色體分布

對(duì)TIR-NBS基因染色體定位分析，圖1結(jié)果顯示，30條TIR-NBS基因不均勻地分布在21條染色體上。其中，有4條 TIR-NBS 基因在scaffold01866上，數(shù)量最多且以串聯(lián)重復(fù)形式出現(xiàn);其次是 1、10、11、scaffold00577、scaffold01435、scaffold02060號(hào)染色體分別有2條TIR-NBS 基因;其余染色體僅有1條TIR-NBS基因。

2.3 TIR-NBS基因的結(jié)構(gòu)組成

利用在線網(wǎng)站工具GSDS對(duì)30條煙草TIR-NBS 基因家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，圖2結(jié)果顯示，TIR-NBS基因家族外顯子數(shù)量主要分布在3～8之間。利用meme對(duì)30條煙草TIR-NBS蛋白序列進(jìn)行分析（圖3），發(fā)現(xiàn)OIT39360所含基序最少，僅6個(gè)基序，其余所含基序都較多，最多為10個(gè)。說(shuō)明該基因家族成員間在功能上可能存在差異。

2.4 TIR-NBS蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、細(xì)胞位置和信號(hào)肽

對(duì)30條煙草TIR-NBS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，TIR-NBS蛋白由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲組成。其中，TIR-NBS蛋白的α-螺旋比例最高，其次是無(wú)規(guī)則卷曲。根據(jù)亞細(xì)胞定位分析，表1結(jié)果顯示煙草TIR-NBS基因家族主要定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體。信號(hào)肽分析結(jié)果表明，TIR-NBS基因家族成員均不含有信號(hào)肽。

2.5 TIR-NBS蛋白的理化性質(zhì)

對(duì)煙草TIR-NBS家族蛋白的特征進(jìn)行分析，表2結(jié)果表明煙草TIR-NBS蛋白長(zhǎng)度范圍在505～1 508 aa之間，相對(duì)分子質(zhì)量大小范圍為46 733.23～172 528.71 Da，理論等電點(diǎn)范圍在5.78～9.40之間，編碼氨基酸序列最長(zhǎng)的是OIT34932，其相對(duì)分子質(zhì)量也最大，為172 528.71 Da;OIT39360相對(duì)分子質(zhì)量最小，為46 733.23 Da。分析表明，TIR-NBS蛋白為不穩(wěn)定蛋白，其中OIT35745的不穩(wěn)定系數(shù)最小，為33.98。TIR-NBS蛋白脂溶指數(shù)為90.09～104.23，總平均親水性為-0.445～-0.115，均為親水性蛋白。

2.6 TIR-NBS基因的進(jìn)化選擇

非同義替換（Ka）和同義替換（Ks）比值Ka/Ks可反映生物進(jìn)化的過(guò)程中所受到的選擇壓力。對(duì)來(lái)源于TIR-NBS亞家族間親緣關(guān)系最近的10條基因成員進(jìn)行Ka/Ks分析，表3結(jié)果顯示該基因?qū)﹂g的Ka/Ks比值均小于1，表明煙草TIR-NBS基因在進(jìn)化時(shí)主要受純化選擇作用。紫色為擬南芥，青色為番茄，紅色字體標(biāo)記為煙草。

2.7 TIR-NBS基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

為了進(jìn)一步了解煙草TIR-NBS基因家族進(jìn)化關(guān)系，利用煙草（30條）、番茄（27條）、擬南芥（176條）共233條TIR-NBS蛋白序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），由圖可知，30條TIR-NBS基因家族成員與番茄的TIR-NBS基因家族親緣關(guān)系相近。

2.8 TIR-NBS基因家族的順式作用元件組成

通過(guò)對(duì)基因上游2 000 bp序列進(jìn)行分析， 預(yù)測(cè)基因的順式作用元件（圖5）。TIR-NBS 基因家族除了存在大量的基本元件CAAT-box和TATA-box外，還存在參與光響應(yīng)順式作用調(diào)節(jié)元件ACE、AE-box、AT1-motif、Box 4、CAG-motif、GA-motif、GT1-motif、G-box，胚乳表達(dá)所需順式作用調(diào)節(jié)元件GCN4-motif，參與種子特異性調(diào)節(jié)的順式作用調(diào)節(jié)元件RY-element。此外，TIR-NBS基因家族中還含有與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用調(diào)節(jié)元件CAT-box、茉莉酸甲酯反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件CGTCA-motif、水楊酸反應(yīng)順式作用元件TCA-ele-ment、低溫響應(yīng)順式元件LTR、防御和應(yīng)激反應(yīng)順式作用元件TC-rich repeats、晝夜節(jié)律控制順式作用調(diào)節(jié)元件circadian、生長(zhǎng)素反應(yīng)順式作用元件AuxRR-core、TGA-element以及赤霉素反應(yīng)順式作用元件TATC-box、P-box等。分析表明，TIR-NBS基因可能受光、 溫度及生長(zhǎng)素、 茉莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸、赤霉素等激素調(diào)控，并可能通過(guò)這些順式作用元件參與了煙草中的防御機(jī)制，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起到防御和保護(hù)植物的作用。

3 討論

TIR-NBS類抗病相關(guān)基因是植物抗病免疫系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分。它主要的抗病調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包括TIR和NBS兩部分，其中植物抗病蛋白（R蛋白）中TIR結(jié)構(gòu)域主要存在于擬南芥和其他雙子葉植物中（Meyers et al.， 2002），而在單子葉植物中，僅發(fā)現(xiàn)了非TIR序列（Tarr， 2009）。TIR結(jié)構(gòu)域是大約有200個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括三個(gè)高度保守的基序（Slack et al， 2000）。目前，已經(jīng)在部分生物中鑒定了TIR-NBS結(jié)構(gòu)域，并證明它與植物致病誘導(dǎo)蛋白和其他植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的相互作用（Nandety et al.， 2013）。但到目前為止，在煙草基因組水平上，僅有少數(shù)TIR-NBS類基因家族被鑒定，對(duì)于大多數(shù)該類基因鮮有報(bào)道。

對(duì)煙草與擬南芥、番茄TIR-NBS類基因家族進(jìn)化關(guān)系分析表明，煙草和番茄的TIR-NBS基因同源性較高，因此煙草和番茄的TIR-NBS基因家族在生物學(xué)功能、生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制上可能存在相似性。當(dāng)植物受到病原菌侵害時(shí)，水楊酸作為發(fā)生超敏反應(yīng)及形成系統(tǒng)獲得性抗性所需要的內(nèi)源信號(hào)分子（陳沖等，2018），其通過(guò)誘導(dǎo)病原相關(guān)蛋白（pathogenesis-related protein， PR蛋白）等多種抗病蛋白產(chǎn)生SAR起作用（汪尚等，2016）。茉莉酸甲酯參與種子萌發(fā)、根生長(zhǎng)、生育、果實(shí)成熟和衰老等多種發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)（叢漢卿，2015）。此外，茉莉酸甲酯還能激活植物防御機(jī)制，對(duì)昆蟲(chóng)引起的傷害、各種致病菌和環(huán)境脅迫（如干旱、低溫和鹽度）作出反應(yīng)（Cheong & Choi， 2003）。通過(guò)對(duì)TIR-NBS基因順式作用元件分析表明，TIR-NBS基因家族中含有防御和應(yīng)激反應(yīng)、低溫響應(yīng)、光響應(yīng)、脫落酸反應(yīng)、MeJA反應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)、分生組織表達(dá)等順式作用元件，可知其不但與植物生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，還參與免疫應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)，這與上述報(bào)道是相符的。

在煙草TIR-NBS類抗病基因家族中，被報(bào)道的基因數(shù)目很少，大多數(shù)基因的功能到目前為止還不清楚。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法概括了煙草基因組中的TIR-NBS類抗病基因的鑒定、基因結(jié)構(gòu)及順式作用分析等，對(duì)于發(fā)掘新的與植物抗病性相關(guān)的基因，加快煙草中抗病機(jī)制的研究具有十分重要的意義，也為煙草的抗病育種研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）