王付娟，李宗震，仝勝利，李淑梅

(1.信陽農(nóng)林學院農(nóng)學院，河南信陽 464000; 2.河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南鄭州 450002)

隨著全球氣候變化，高溫和干旱已經(jīng)嚴重影響到小麥碳同化和淀粉合成，造成產(chǎn)量和品質的下降[1-2]。干旱常常伴隨高溫，高溫直接導致許多不耐熱蛋白質變性和植物細胞中活性氧(ROS)積累[3-4]。植物在進化過程中形成了應對逆境脅迫的調控機制，包括誘導大量熱激蛋白(heat shock protein,Hsps)和ROS清除劑等基因的表達。在熱適應過程中，熱激蛋白轉錄因子(heat shock factors,Hsfs)對熱誘導的重建轉錄起著重要的調控作用[5]。

熱激蛋白轉錄因子廣泛存在于所有真核生物中。Hsfs蛋白的特征是存在一個Hsf DNA結合域，該域由一個中心螺旋-旋轉-螺旋基序和兩個疏水氨基酸重復片段(HR-A and HR-B)組成[6]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定，擬南芥中21個Hsf蛋白[7]，水稻中25個Hsf蛋白[7-8]，大麥中28個Hsf蛋白[9]，大豆中34個Hsf蛋白[10]，棉花中40個Hsf蛋白[11]，小麥中56個Hsf蛋白[12]。根據(jù)蛋白質結構將Hsf蛋白劃分為A、B和C三個亞家族，HsfA已經(jīng)在擬南芥和水稻等植物中被廣泛研究，發(fā)現(xiàn)AtHsfA1a和AtHsfA1b參與調節(jié)擬南芥應激基因的早期表達[13]；過表達GmHsfA1能夠顯著提高大豆的耐熱性[14-15]；擬南芥中超表達AtHsfA2基因，其耐強光、耐鹽、耐高滲透脅迫和抗氧化能力顯著提高[15-17]。超表達OsHsfA2e使擬南芥的耐鹽能力顯著提高[18]，但超表達SlHsfA3使擬南芥的鹽敏感性顯著提高[19]。水稻和小麥中超表達HsfA4a均顯著提高其抗重金屬元素鎘的能力和抗氧化能力[20]。HsfB亞家族成員在植物受高溫脅迫時發(fā)揮著重要作用，擬南芥中HsfB1和HsfB2b在正常條件下抑制HsfA2和HsfA7基因的表達，對植株提高耐熱性發(fā)揮積極作用[21]。有研究表明，擬南芥HsfB1和HsfB2b在提高抗病性方面也發(fā)揮著積極作用[22]。水稻中HsfC基因除了在熱脅迫反應中發(fā)揮作用外，還參與了對鹽、干旱和氧化應激等的應激反應[23-25]。OsHsfC1b和OsHsfC2b對鹽和干旱非常敏感，TaHsfC2a-B在小麥籽粒灌漿過程中發(fā)揮著熱保護作用[26]。

小麥作為重要的糧食作物，揚花期和灌漿期遭遇干熱風和干旱的頻率激增，更多有重要功能的熱激蛋白轉錄因子有待挖掘，尤其是TaHsfC亞家族基因。為深入了解此基因的功能，本研究擬通過小麥全基因組生物信息學分析，根據(jù)擬南芥和水稻HsfC家族成員蛋白的保守結構域鑒定小麥HsfC家族成員，并利用不同小麥品種在干旱條件下的轉錄組數(shù)據(jù)分析其表達模式，為探究TaHsfCs介導小麥對干旱脅迫的響應提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TaHsfC全基因組檢索以及鑒定

根據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫(Tair:https://www.arabidopsis.org/)中公布的AtHsfC1(AT3G24520)所編碼的氨基酸序列，通過Hmmer(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)工具獲得其Pfam號，然后利用Pfam號通過數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/biomart/martview/)在小麥基因組數(shù)據(jù)庫中進行比對，獲得TaHsf家族候選基因的堿基、蛋白的氨基酸和CDS序列。將候選基因對應蛋白質的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的AtHsfC1(AT3G24520)、OsHsfC2a(Os02g13800)、OsHsfC2b(Os06g35960)、OsHsfC1a(Os01g43590)和OsHsfC1b(Os01g53220)的對應氨基酸序列進行同源進化分析，利用 Mega7.0 軟件構建進化樹，構建方法為鄰近法。以進化關系距離大于80%為標準確定TaHsfC亞家族成員。

1.2 TaHsfC生物信息學分析

利用 Mega 7.0 軟件構建TaHsfC蛋白序列進化樹，構建方法為鄰近法，bootstrap設置為 1 000。用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線軟件分析TaHsfC基因結構。利用Softberry(http://linux1.softberry.com/)在線軟件進行TaHsfC亞細胞定位預測。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)查詢TaHsfC蛋白質的HSF結構域位置和卷曲螺旋位置。利用MG2C在線軟件(http://mg2c.iask.in/mg2cv2.0/)繪制TaHsfC基因在各染色體上的位置。

1.3 TaHsfC對干旱脅迫的響應

以矮抗58(不耐旱品種)和晉麥47(耐旱品種)作為研究材料，將萌發(fā)5 d的苗移栽到營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d之后，采用添加15%的PEG的營養(yǎng)液模擬干旱處理24 h，以正常培養(yǎng)的苗為對照，分別取根系提取RNA，構建cDNA文庫，進行轉錄組測序。根據(jù)測序結果，分析響應干旱的TaHsfC基因表達情況，用 Cufflinks 軟件(http://cufflinks.cbcb.umd.edu/)計算各基因或轉錄本的表達豐度，表達豐度用FPKM值來表示。根據(jù)各樣本轉錄組數(shù)據(jù)中各TaHsfC基因的 FPKM 值對其基因表達模式進行分析，用TBtools軟件中的Heatmap工具對表達模式作圖。

2 結果與分析

2.1 TaHsfC在染色體上的分布及亞細胞定位

從小麥全基因組中共鑒定到24個TaHsfC基因(表1)，其不均勻分布在5條染色體上，其中A基因組中有7個，B 基因組中9個，D基因組中有6個，另外兩個所在染色體位置不清楚(圖2)。在3號染色體上最多，有12個；在4號染色體上有5個；5號染色體上有2個；7號染色體上有3個；有2 個基因在染色體上的位置未知。對24個TaHsfC基因進行亞細胞定位預測分析顯示，24個TaHsfC基因全部定位于細胞核。

表1 小麥TaHsfC基因家族的特性

圖1 小麥TaHsfC家族基因的染色體分布

*代表新鑒定的TaHsfC蛋白。

2.2 小麥TaHsfC聚類分析

TaHsfC蛋白的亞類分類方法是基于Scharf等[5]對擬南芥和水稻Hsf蛋白分類。由圖2可以看出，與已鑒定的擬南芥和水稻中的HsfC蛋白(AtHsfC1、OsHsfC2a、OsHsfC2b、OsHsfC1a和OsHsfC1b)進行聚類比對，24個被鑒定的TaHsfC蛋白成員可以明顯的分為兩大類。其中，有 12個TaHsfC蛋白已經(jīng)被報道過[12]，分別為 TaHsfC1a-e和TaHsfC2a-g。新鑒定的12個TaHsfC蛋白聚類為兩組，分別命名為TaHsfC1f-k和TaHsfC2h-m(圖2中被標記*)。與擬南芥相比，小麥HsfC蛋白與水稻HsfC蛋白的聚類更緊密，并且HsfC2亞族在單子葉植物中是唯一的。

2.3 小麥TaHsfC基因結構及保守結構域分析

對鑒定的24個TaHsfC基因進行基因結構分析，結果表明，TaHsfC1亞族基因至少含有一個內含子，其中TaHsfC1h含有兩個內含子；TaHsfC2亞族基因則規(guī)律不清，其中TaHsfC2a、TaHsfC2b和TaHsfC2m含有一個內含子，其余成員則不含內含子。

24個TaHsfC基因中，有7組同源基因，同源基因的結構具有相似性(圖3)，其中有5組可能為A、B和D染色體組上的等位基因(c2e、c2g、c2i;c2a、c2b、c2m;c1b、c1c、c1d;c1a、c1e、c1f;c1j、c1h、c1k)，另外2組可能為其中兩組染色體上的等位基因(c2j、c2k;c2c、c2l)。

圖3 小麥TaHsfCs基因結構分析

小麥TaHsfCs序列的保守結構域分析結果顯示(圖4)，所有被鑒定的小麥TaHsfCs中均有基序1(motif 1)、基序2(motif 2)和基序3(motif 3)，其中TaHsfC2a中包含HSF的AHA基序(AHA motif序列：LLLDGDFGNVSAFGPDAVDFAGFYTDDAFANAPVPVE)。

圖4 小麥TaHsfCs的保守結構域分析

小麥HsfCs DNA結合結構域的多序列比對分析結果顯示(圖5)，小麥HsfC亞族蛋白質包含“螺旋-折疊-螺旋”的結構域，屬于DNA結合結構域，具有DNA結合特性，所鑒定的24個小麥HsfCs功能可能具有相似性。

圖5 小麥HsfCs DNA結合域的多序列比對

2.4 TaHsfC基因對干旱脅迫的響應

以矮抗58和晉麥47兩個品種的轉錄組數(shù)據(jù)分析響應干旱的TaHsfC基因，將達到顯著差異的TaHsfC基因通過FPKM值制作熱圖(圖6)。從圖6可見，小麥品種矮抗58和晉麥47共同存在差異表達的TaHsfC基因有10個，占比 66.7%，其中TaHsfC2亞族基因占70%，且表達量均高于TaHsfC1亞族基因。表明TaHsfC2亞族基因在響應干旱脅迫中具有重要的作用。其中，TaHsfC2b、TaHsfC2c、TaHsfC2d、TaHsfC2f、TaHsfC2g和TaHsfC2m在兩個品種中受干旱脅迫誘導表達上調幅度最大，表明這些基因在小麥干旱脅迫中發(fā)揮著積極響應作用。不同的TaHsfC1和TaHsfC2亞族基因在干旱響應中的表達存在較大差異，整體以TaHsfC2亞族基因在干旱處理過程中上調表達倍數(shù)較高，TaHsfC1亞族基因上調表達倍數(shù)則相對較低。晉麥47在干旱處理中有4個基因(TaHsfC2j、TaHsfC2k、TaHsfC1f和TaHsfC1c)未表現(xiàn)出顯著變化，而TaHsfC2i在晉麥47中表現(xiàn)出顯著差異。

圖6 響應干旱脅迫的TaHsfC基因的表達模式分析

3 討 論

本研究在小麥基因組中共鑒定了24個TaHsfC亞族基因成員，可以分為TaHsfC1和TaHsfC2兩個亞族。從進化樹分析可見，小麥的TaHsfC亞族基因與水稻更為緊密。與擬南芥不同的是，小麥和水稻均有TaHsfC2亞族基因，這是禾本科植物所特有的一類基因。大量研究表明，熱激蛋白轉錄因子是一個龐大的基因家族，可以被分為A、B和C三個亞家族，且在植物的耐熱、抗寒、抗旱及耐鹽等多種脅迫條件下發(fā)揮重要作用，但是由于小麥基因組的復雜性，對其TaHsfC亞族基因的功能研究仍然較少，已經(jīng)公開報道的只有TaHsfC2a通過ABA介導調控途徑參與小麥灌漿期的耐熱性保護機制[26]。本研究主要利用小麥基因組和轉錄組數(shù)據(jù)對TaHsfC亞族基因進行全基因組系統(tǒng)分析，試圖為研究TaHsfC亞族基因的功能提供理論基礎。

在聚類分析中發(fā)現(xiàn)，鑒定出的24個TaHsfC亞族基因中存在5組三聯(lián)等位基因和2組二聯(lián)等位基因，其親緣關系高度相似，這可能與六倍體小麥復雜的基因組相關，基因之間存在多個復制。前人研究報道，隨著基因組的復雜性增加，熱激蛋白轉錄因子的數(shù)量也隨之增加；這種家族基因數(shù)量的增加意味著該基因家族可能在植物應對環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要作用[27]。在鑒定的24個TaHsfC亞族基因中，均具有熱激蛋白轉錄因子的保守結構域。這24個被鑒定的小麥TaHsfC亞族基因的成員中，有12個是本研究初次發(fā)現(xiàn)，這為以后的研究提供了一定的基礎信息。通過亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)，全部的TaHsfC定位于細胞核，這與其功能密切相關，轉錄因子參與調控下游靶基因的轉錄，而轉錄過程是在細胞核內進行的。

大部分Hsfs家族成員是通過調控一系列熱激蛋白，活性氧清除酶和其他功能蛋白基因發(fā)揮抗逆作用的[28]。熱激轉錄因子的下游基因熱激蛋白作為分子伴侶可以防止細胞蛋白質在熱應激下變性[27-28]，同時也參與生物體對熱脅迫的適應[29]。Hu等[26]研究表明，小麥中過表達TaHsfC2a-B基因能夠上調一系列熱保護基因，包括TaHSP16.9b、TaHSP17.3、TaHSP26.6、TaHSP62.4、TaHSP70d、HSP101b、TaGalSyn、TaHSA32、TaRof1和TaβAmy1。本研究證明了TaHsfC2a可被干旱誘導上調表達；但是過表達TaHsfC2a-B基因并不能提高小麥的抗旱性，TaHsfC2a-B過表達能夠抑制植株的生長；在各個營養(yǎng)器官中TaHsfC2a基因干旱誘導的生理意義可能在于干旱脅迫下水分的保存。在本研究中，耐旱品種晉麥47和干旱敏感型品種矮抗58中均表現(xiàn)出TaHsfC2a基因在干旱條件下上調表達。本研究鑒定到的TaHsfC2b和TaHsfC2m與TaHsfC2a具有極高的同源性，此三者之間的功能有可能也是相似的。盡管其他的TaHsfC2亞族基因也能夠受到干旱脅迫的誘導，但是具體的功能則有待進一步的研究。