王 玉,張 晶,曹 云,吳華山,黃紅英*,劉愛民
(1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽 蕪湖241000;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院循環(huán)農(nóng)業(yè)研究中心,南京210014;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京210014;4.江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心,南京210014)
目前,畜禽糞便的利用仍然是個(gè)難題,堆肥是實(shí)現(xiàn)畜禽糞便資源化、無害化、減量化利用的重要途徑。然而傳統(tǒng)堆肥也面臨著許多問題,諸如發(fā)酵溫度低、發(fā)酵周期長、無害化不徹底、臭味污染嚴(yán)重等。近年來,有研究表明[1-2],在堆肥過程中接種菌劑,能有效提高堆肥腐熟度,縮短堆肥周期。然而也有研究表明[3-4],外源接種菌劑并不能在堆肥過程中很好地發(fā)揮作用。究其原因,主要是接種的微生物與土著微生物相比,對(duì)堆肥環(huán)境的適應(yīng)性差,導(dǎo)致對(duì)堆肥有機(jī)物分解利用不充分,從而達(dá)不到預(yù)期效果。因此,如何獲得對(duì)堆肥環(huán)境適應(yīng)性好,并能穩(wěn)定發(fā)揮作用的微生物菌劑是研究重點(diǎn)。
根據(jù)環(huán)境中微生物最適生長溫度的不同,可以將其分為嗜冷微生物(<20 ℃)、嗜溫微生物(25~40 ℃)、嗜熱微生物(40~60 ℃)、極端嗜熱微生物(60~85 ℃)和超嗜熱微生物(>85 ℃)[5]。Oshima 等[6]首次發(fā)現(xiàn)極端嗜熱微生物在高溫堆肥過程中具有非常重要的作用。廖漢鵬等[7]發(fā)現(xiàn)土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、棲熱菌屬(Thermus)和Calditerricola等屬的極端嗜熱菌對(duì)提高堆肥堆體溫度、促進(jìn)堆肥腐熟的作用顯著。目前,國內(nèi)外關(guān)于堆肥用極端嗜熱菌劑的報(bào)道不多,尤其是針對(duì)堆肥環(huán)境制備具有良好適應(yīng)性和功能性的極端嗜熱菌劑產(chǎn)品更是少有研究。為此,本研究從不同高溫堆肥樣品中篩選既能在高溫、高pH、高鹽濃度的畜禽糞便堆肥環(huán)境中存活,且同時(shí)具備大分子有機(jī)物降解能力的極端嗜熱功能菌,按一定要求復(fù)配成極端嗜熱菌劑,在豬糞堆肥中添加該復(fù)配菌劑,并考察不同堆肥時(shí)期的種子發(fā)芽指數(shù)、腐殖質(zhì)組分及含量的變化來確定復(fù)配菌劑促進(jìn)堆肥腐熟、提高堆肥品質(zhì)的效果,以期獲得具有商業(yè)價(jià)值的極端嗜熱菌劑。
分菌樣品取自江蘇、湖南等地不同有機(jī)肥廠的高溫期畜禽糞便及秸稈堆肥。
新鮮豬糞取自江蘇鎮(zhèn)江樂甜仕豬場(chǎng),水稻秸稈取自江蘇省農(nóng)科院水稻試驗(yàn)基地。
培養(yǎng)基:(1)LB 培養(yǎng)基為胰蛋白胨10 g·L-1,酵母浸粉5 g·L-1,NaCl 10 g·L-1,pH 7.2~7.4。固體培養(yǎng)基每1 L 加瓊脂10 g 和結(jié)冷膠10 g。(2)富集培養(yǎng)基為NH4NO31.0 g·L-1,K2HPO41.5 g·L-1,KH2PO40.5 g·L-1,MgSO40.2 g·L-1,NaCl 1.0 g·L-1,胰蛋白胨0.2 g·L-1,酵母浸粉0.2 g·L-1,pH 7.0。
菌株分離:取不同堆肥高溫期的樣品10 g,放入90 mL 富集培養(yǎng)基中,60 ℃振蕩培養(yǎng)3 d 后,以5%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的富集培養(yǎng)基中,65 ℃振蕩培養(yǎng)3 d,按相同方法再次轉(zhuǎn)接,70 ℃振蕩培養(yǎng)3 d。吸取第3次富集液梯度稀釋后涂布于LB 固體培養(yǎng)基上,將平板置于70 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,挑取形態(tài)不同的單菌落,進(jìn)一步劃線純化。最終分離出的單菌置于終濃度為10%的甘油中,-80 ℃保存。
菌株鑒定:各菌株提取總DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNA序列通用引物27F/1492R,擴(kuò)增體系及程序參考文獻(xiàn)[8],擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行blast比對(duì),運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
溫度對(duì)菌株生長的影響:以2%的接種量,將新鮮菌體接種到LB 液體培養(yǎng)基中,置于不同的生長溫度下(35、45、55、65、70、75、80 ℃)振蕩培養(yǎng),24 h后取樣測(cè)定其在OD600處的吸光值。
pH 對(duì)菌株生長的影響:以2%的接種量,將新鮮菌體接種到LB 液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基pH 分別為3.5、5.5、6.5、7.5、9.5和11.5,65 ℃振蕩培養(yǎng),24 h后取樣測(cè)定其在OD600處的吸光值。
鹽濃度對(duì)菌株生長的影響:以2%的接種量,將新鮮菌體接種到NaCl含量分別為1、5、10、20、50 g·L-1和100 g·L-1的LB液體培養(yǎng)基中(pH 7.2~7.4),65 ℃振蕩培養(yǎng),24 h后取樣測(cè)定其在OD600處的吸光值。
蛋白酶活力的測(cè)定:采用福林(Folin)法測(cè)定蛋白酶活力[9],粗酶液與2%酪蛋白溶液分別在不同溫度下(70、80、85、90、95 ℃)反應(yīng)20 min,加入三氯乙酸終止反應(yīng),上清液加入碳酸鈉和福林試劑進(jìn)行顯色反應(yīng),測(cè)定OD680處的吸光值,根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生成的酪氨酸量。酶活單位定義:一定條件下每分鐘水解酪蛋白溶液生成1 μg 酪氨酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。
淀粉酶活力的測(cè)定:采用DNS 法測(cè)定淀粉酶活力[10],粗酶液與1%的淀粉溶液分別在不同溫度下(70、80、85、90、95 ℃)反應(yīng)10 min,加入DNS 試劑進(jìn)行顯色反應(yīng),測(cè)定OD540處的吸光值,根據(jù)麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生成的麥芽糖量。酶活單位定義:一定條件下每分鐘水解淀粉釋放1μmol 還原糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。
木聚糖酶活力的測(cè)定:采用DNS 法測(cè)定木聚糖酶活力[11],粗酶液與1%木聚糖溶液分別在不同溫度下(70、80、85、90、95 ℃)反應(yīng)10 min,加入DNS 試劑進(jìn)行顯色反應(yīng),測(cè)定OD540處的吸光值,根據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生成的木糖量。酶活單位定義:一定條件下每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生1μmol 還原糖(以木糖計(jì))所需的酶量為1個(gè)酶活性單位。
脂肪酶活力的測(cè)定:采用滴定法測(cè)定脂肪酶活力[12],粗酶液與橄欖油乳化液分別在不同溫度下(70、80、85、90、95 ℃)反應(yīng)20 min,用NaOH滴定計(jì)算生成的脂肪酸量。酶活單位定義:一定條件下每分鐘水解底物釋放1μmol脂肪酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。
根據(jù)菌株生長特性和酶活測(cè)定結(jié)果,挑選出6 株菌(NN-86、NY-44、LB-3、B、D、E)用于構(gòu)建具有較好環(huán)境耐受性和有機(jī)物降解能力的復(fù)合菌劑。進(jìn)一步通過拮抗試驗(yàn)確認(rèn)各復(fù)配菌株間不存在拮抗現(xiàn)象。將各菌株分別培養(yǎng)制備成菌懸液后,取各菌株種子液等比例混合后接種于新鮮培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng),至培養(yǎng)液中有效活菌數(shù)≥1×108cfu·mL-1時(shí)即獲得極端嗜熱復(fù)合菌劑。
堆肥所用原料的基本性質(zhì)見表1。
表1 堆肥原料的理化性質(zhì)Table 1 Physiochemical properties of raw materials for composting
采用實(shí)驗(yàn)室模擬堆肥方法,將豬糞(主料)和秸稈(輔料)按比例混合,調(diào)節(jié)初始C/N 為25,初始含水率為65%。試驗(yàn)設(shè)常規(guī)堆肥(未接種)和接種極端嗜熱菌劑堆肥(接種,2%接種量),為排除培養(yǎng)基對(duì)堆肥結(jié)果的影響,常規(guī)堆肥組加入2%的液體培養(yǎng)基,每個(gè)處理組重復(fù)3 次。將盛有混合物料的小型堆肥裝置(2 L 圓形帶蓋塑料桶)放入烘箱中,模擬自然高溫堆肥溫度變化控制堆體溫度,堆肥過程中的溫度控制條件見圖1。每隔2 d 翻堆一次,分別在第0、6、12、18、24、30 d 和42 d 取樣,測(cè)定堆肥各時(shí)期的GI 及腐殖質(zhì)、胡敏酸和富里酸含量。GI 測(cè)定參照Ke 等[13]的方法進(jìn)行,具體計(jì)算公式見式(1)。
堆肥腐殖質(zhì)及其組分的測(cè)定采用焦磷酸鈉提取-重鉻酸鉀氧化容量法。
圖1 模擬堆肥溫度控制Figure 1 Temperature control in the mimic experiment
堆肥高溫期樣品經(jīng)過富集培養(yǎng)和分離純化,共得到9株能在70 ℃生長的極端嗜熱菌株,各菌株的菌落形態(tài)見圖2,詳細(xì)形態(tài)描述見表2。16S rDNA 序列比對(duì)結(jié)果表明(表2):菌株NN-36、NN-86、LB-3、B與土芽孢桿菌屬相似度最高;菌株NY-44 與副土芽孢桿菌屬相似度最高;菌株80-31、80-39、E與棲熱菌屬相似度最高;菌株D 與紅嗜熱菌屬相似度最高。同時(shí),從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可知(圖3):菌株NN-36、NN-86、LB-3、B與土芽孢桿菌屬聚為一類,因此初步鑒定其為Geobacillussp.;菌株NY-44 與副土芽孢桿菌屬聚為一類,因此初步鑒定其為Parageobacillussp.;菌株80-31、80-39、E與棲熱菌屬聚為一類,因此初步鑒定其為Thermussp.;菌株D 與紅嗜熱菌屬聚為一類,因此初步鑒定其為Rhodothermussp.。Geobacillussp.和Thermussp.是堆肥高溫期常見優(yōu)勢(shì)菌株[14-15],Para?geobacillussp.和Rhodothermussp.在堆肥中少有報(bào)道。本研究從高溫堆肥環(huán)境分離獲得的極端嗜熱菌中,土芽孢桿菌和棲熱菌占比高達(dá)80%左右,與前人研究結(jié)果一致。
表2 菌株16S rDNA序列相似性分析及菌落形態(tài)描述Table 2 Similarity analysis of the 16S rDNA sequences of the isolated strains and descriptions of colony morphology
圖2 9株菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Figure 2 Colony morphology of nine strains on the LB medium
2.2.1 菌株的生長特性
溫度是影響菌株生長、繁殖、新陳代謝的重要指標(biāo)之一。由圖4a 可以看出,菌株80-31、80-39、D、E的最適生長溫度為70 ℃,菌株NN-36、NN-86、NY-44、LB-3 和B 的最適生長溫度為65 ℃。近年來已有研究表明提高堆體溫度可加速腐殖化進(jìn)程,縮短發(fā)酵周期[16-17]。在傳統(tǒng)過程堆肥中溫度超過70 ℃將抑制幾乎所有微生物(包括嗜熱微生物)的活性,導(dǎo)致后續(xù)堆肥過程難以穩(wěn)定運(yùn)行,因此分離篩選最適生長溫度為65 ℃和70 ℃的高溫菌株資源并應(yīng)用到堆肥中具有重要意義。
由圖4b 可知,各個(gè)菌株對(duì)鹽濃度的耐受能力不同。多數(shù)菌株的最適生長鹽濃度為10 g·L-1,而菌株NY-44 的最適生長鹽濃度是20 g·L-1,比其他菌株能耐受更高鹽濃度,屬于嗜鹽菌[18]。
由圖4c 可知,所分離菌株都能在pH 7.5 以上生長,都屬于耐堿菌。其中菌株NY-44、D 和E 的最適生長pH 為9.5,屬于嗜堿菌[19]。曹云等[20]在研究畜禽糞便堆肥前期理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn),堆肥前期由于微生物分解蛋白質(zhì)類有機(jī)物產(chǎn)生氨氮,促使pH 值上升,pH 可達(dá)到8~9。
圖3 9株菌株基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of nine strains based on 16S r DNA sequences
綜上,所分離菌株具有耐高溫、耐堿和耐鹽等特性,而堆肥過程是有著高溫、高pH 和高鹽環(huán)境的,菌株的這些特性有助于它們?cè)诙逊蔬^程中更好地適應(yīng)堆肥環(huán)境從而存活,而這也是菌劑在堆肥中發(fā)揮功能的先決條件。
2.2.2 菌株不同溫度條件下的酶活性質(zhì)
圖4 溫度、NaCl濃度、pH值對(duì)各菌株生長的影響Figure 4 Effects of temperature,NaCl concentration,and pH value on the growth of each strain
圖5 各菌株在不同溫度下的蛋白酶活、淀粉酶活、木聚糖酶活和脂肪酶活Figure 5 Protease activity,amylase activity,xylanase activity,and lipase activity of each strain at different temperatures
如圖5a 所示,所分離菌株都能檢測(cè)出高溫蛋白酶活性,菌株NN-36 和NY-44 所產(chǎn)蛋白酶在80 ℃酶活最大,分別為25.6 U·mL-1和21.8 U·mL-1;菌株NN-86、LB-3和D所產(chǎn)蛋白酶均在90 ℃酶活最大,分別為22.9、23.3 U·mL-1和29.1 U·mL-1。所有菌株均能檢測(cè)出高溫淀粉酶和木聚糖酶活性,但活性都較弱,其中菌株B所產(chǎn)淀粉酶在70 ℃酶活最大,為0.20 U·mL-1;菌株E 所產(chǎn)木聚糖酶在70 ℃酶活最大,為0.25 U·mL-1(圖5b、圖5c)。如圖5d所示,只有菌株NY-44、NN-36和B 檢測(cè)到了脂肪酶活,且活性均不高,其中菌株NY-44所產(chǎn)脂肪酶在70 ℃酶活最大,為1.80 U·mL-1。
有研究表明,土芽孢桿菌可產(chǎn)生多種高溫酶,比如高溫蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶等[21]。本研究結(jié)果也證明土芽孢桿菌同時(shí)具有高溫蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶活性,且部分土芽孢桿菌還同時(shí)具備脂肪酶活性,說明土芽孢桿菌有較強(qiáng)的飼料酶系[22-23],有利于堆肥過程中大分子有機(jī)物的降解,從而促進(jìn)堆肥升溫和腐熟。高溫菌所產(chǎn)的降解酶具有較好的熱穩(wěn)定性,能將發(fā)酵溫度維持在較高的溫度下,可以更加有效地殺死病原微生物,達(dá)到衛(wèi)生化的要求。此外,高溫酶不僅耐熱,而且對(duì)不良化學(xué)環(huán)境也具有高度的耐受性,從而能提高有機(jī)廢棄物處理效率,縮短堆肥生產(chǎn)周期。
2.3.1 極端嗜熱菌劑的復(fù)配
經(jīng)過比較各菌株生長特性和不同溫度下的酶活結(jié)果:NY-44 既是嗜堿菌又是嗜鹽菌;D 和E 是嗜堿菌;NN-86、LB-3 在90 ℃時(shí)有最大蛋白酶活;菌株B能產(chǎn)脂肪酶和淀粉酶。最終選擇NN-86、NY-44、LB-3、B、D 和E 這6 株菌用于復(fù)配耐堿、耐鹽和具備良好蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪和半纖維素高溫降解能力的極端嗜熱菌劑。
2.3.2 極端嗜熱菌劑對(duì)堆肥GI的影響
GI 是判斷堆肥腐熟程度極為重要的指標(biāo)之一。不同堆肥處理的GI變化如圖6所示。在堆肥過程中,接種和未接種處理的GI都呈先下降再上升的趨勢(shì),且兩組處理均在12 d 時(shí)GI 降到最低。堆肥初期發(fā)芽指數(shù)降低可能是因?yàn)橛袡C(jī)物降解產(chǎn)生大量酚類化合物、揮發(fā)性有機(jī)酸和氨等植物毒素[24-25]。12 d后接種和未接種處理的GI 均呈逐漸上升趨勢(shì),且接種處理的GI增加更為迅速,在30 d即達(dá)到了56.8%,已達(dá)到基本腐熟標(biāo)準(zhǔn)[26],而此時(shí)未接種堆肥的GI 僅為41.8%。堆肥結(jié)束時(shí),接種處理的GI 為72.1%,比未接種處理高14.8%,堆肥結(jié)束時(shí),未接種處理與接種處理的GI均超過50%,表明此時(shí)堆體已無明顯植物毒性[27]。以上結(jié)果說明接種極端嗜熱菌劑有利于加快豬糞堆肥的腐熟進(jìn)程,從而縮短堆肥周期。
圖6 堆肥過程中種子發(fā)芽指數(shù)(GI)變化Figure 6 Changes of GI during composting
2.3.3 極端嗜熱菌劑對(duì)堆肥腐熟進(jìn)程的影響
在堆肥過程中,有機(jī)質(zhì)在微生物的作用下,進(jìn)行降解的同時(shí)還進(jìn)行著腐殖化的過程。從圖7a 可以看出,接種和未接種堆肥總腐殖質(zhì)含量均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)。堆肥12 d 后接種處理的腐殖質(zhì)含量一直高于未接種組,直至堆肥結(jié)束,接種處理腐殖質(zhì)含量較未接種高出4.2%。堆肥結(jié)束時(shí),接種處理和未接種處理腐殖質(zhì)含量較初始值分別降低了12.8%和16.3%?,F(xiàn)有研究關(guān)于堆肥過程腐殖質(zhì)總量變化趨勢(shì)沒有統(tǒng)一結(jié)論,與堆肥原料以及堆肥工藝的選擇有關(guān)。鮑艷宇等[28]研究以奶牛糞為原料的堆肥,發(fā)現(xiàn)腐殖質(zhì)碳呈逐漸增加的趨勢(shì)。本研究結(jié)果與曹云等[29]的研究結(jié)果相一致,以豬糞為原料堆肥時(shí),堆肥腐熟后腐殖質(zhì)總含量與初始相比均降低。
胡敏酸是一種分子量大、穩(wěn)定性高的物質(zhì)。圖7b 顯示,在整個(gè)堆肥過程中胡敏酸含量總體呈現(xiàn)先略降低后逐漸上升的趨勢(shì)。堆肥12 d 后接種處理的胡敏酸含量一直高于未接種組,直至堆肥結(jié)束,接種處理胡敏酸含量較未接種高出7.8%。42 d 時(shí),接種處理和未接種處理胡敏酸含量分別為52.87 g·kg-1和49.03 g·kg-1,較初始值分別提高了58.0%和46.5%。富里酸是腐植酸中分子量較小、活性較大、氧化程度較高的組分[30]。由圖7c可知,堆肥過程中富里酸含量呈下降趨勢(shì),這主要是由于富里酸類物質(zhì)分子量相對(duì)較小、分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,易被微生物降解。堆肥結(jié)束時(shí),未接種處理和接種處理富里酸含量分別是34.97 g·kg-1和34.63 g·kg-1,差異不顯著。
圖7 堆肥過程中總腐殖質(zhì)、胡敏酸、富里酸、HA/FA變化Figure 7 Dynamics of humic substance,humic acid,fulvic acid,and HA/FA during composting
胡敏酸和富里酸含量的比值(HA/FA)是評(píng)價(jià)堆肥腐殖化程度的一個(gè)重要指標(biāo),能較好地反映出堆肥過程中腐殖質(zhì)的聚合程度[31-32]。如圖7 d 所示,在整個(gè)堆肥過程中,各處理的HA/FA 總體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。18 d 后,接種處理HA/FA 一直高于不接種處理組,42 d 時(shí),接種處理的HA/FA 較未接種處理高出7.1%。有研究表明[33-34],堆肥過程中HA/FA 值在1.4以上,就可以判斷堆肥腐熟。在42 d 時(shí),兩組處理都超過1.4,說明堆肥結(jié)束時(shí),兩組堆肥都已腐熟。但接種處理的HA/FA 在第36 d 時(shí)已達(dá)到1.4,達(dá)到腐熟時(shí)間縮短了6 d。
結(jié)果表明,接種極端嗜熱菌劑對(duì)豬糞堆肥腐殖質(zhì)組成及含量的變化有著顯著影響。接種菌劑促進(jìn)了腐殖化進(jìn)程,有利于胡敏酸的形成,提高了HA/FA,表明接種極端嗜熱菌劑可以提高豬糞堆肥的腐殖化程度,提高堆肥產(chǎn)品質(zhì)量。
(1)本研究從高溫堆肥環(huán)境中篩選出9株極端嗜熱菌,經(jīng)16S rDNA序列同源性比對(duì),鑒定為:Geobacil?lussp.4 株,Thermussp.3 株,Parageobacillussp.1 株,Rhodothermussp. 1 株。Geobacillussp.和Thermussp.是堆肥高溫期常見優(yōu)勢(shì)菌株,Parageobacillussp.和Rhodothermussp.在堆肥中的應(yīng)用少有報(bào)道,本研究為堆肥高溫菌劑制備擴(kuò)充了菌種資源。
(2)所分離菌株最適生長溫度均在65~70 ℃;NY-44、D 和E 最適生長pH 為9.5,屬于嗜堿菌,其中NY-44最適生長鹽濃度是20 g·L-1,同時(shí)屬于嗜鹽菌;所分離土芽孢桿菌同時(shí)具有高溫蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶活性,且部分土芽孢桿菌還兼具高溫脂肪酶活性,有利于堆肥過程中大分子有機(jī)物的降解。
(3)堆肥結(jié)束時(shí),接種極端嗜熱菌劑的處理與未接種相比,GI 提高了14.8%,總腐殖質(zhì)含量和胡敏酸含量分別增加了4.2%和7.8%,HA/FA 高出了7.1%。可見,接種本研究的極端嗜熱菌劑有利于加快堆肥腐熟,增強(qiáng)堆肥的腐殖化程度和堆肥產(chǎn)品質(zhì)量。對(duì)復(fù)配菌株比例的優(yōu)化可能會(huì)進(jìn)一步提升該極端嗜熱菌劑促進(jìn)堆肥腐熟效果,有待后續(xù)研究確認(rèn)。