陳綺，雷文平，肖茜，姚慧，羅潔，劉成國(guó)，周輝

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2. 湖南省食品科學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；3. 湖南南山牧業(yè)有限公司，湖南城步422512）

0 引 言

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB) 是一類能在生長(zhǎng)代謝的過(guò)程中利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌，在自然界分布廣泛，種類繁多，截至目前為止共有23 個(gè)屬，200 多個(gè)種，菌株不計(jì)其數(shù)[1]。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外的一種糖類高聚物的總稱[2-3]。乳酸菌胞外多糖可以作為一種天然的食品添加劑，改善食品黏稠度、質(zhì)地和風(fēng)味等[4]，因此被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5-7]。乳酸菌EPS 能夠賦予牛乳獨(dú)特的質(zhì)地與口感，同時(shí)能夠增加發(fā)酵乳制品的粘稠度減少乳清析出[8]。

產(chǎn)胞外多糖乳酸菌與發(fā)酵劑協(xié)同發(fā)酵乳制品，旨在改善乳制品質(zhì)地和口感，并利用乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖，改善乳制品黏度，增加乳制品的安全性。將產(chǎn)胞外多糖菌珠Y5 與不產(chǎn)胞外多糖的LB、ST 菌株按照2%接種量接種到牛乳中，結(jié)果表明菌株Y5 的乳清析出量減少，證明產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌能夠提高產(chǎn)品的粘稠性[9]。

本研究以產(chǎn)胞外多糖植物乳桿菌XN1904E 為研究對(duì)象，將其與直投式發(fā)酵劑協(xié)同發(fā)酵組、發(fā)酵劑單獨(dú)發(fā)酵組和植物乳桿菌XN1904E 單獨(dú)發(fā)酵組進(jìn)行發(fā)酵特性研究，測(cè)定發(fā)酵乳的多糖含量，并利用氣相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)對(duì)各組發(fā)酵乳制品進(jìn)行風(fēng)味分析，該研究為開(kāi)發(fā)利用產(chǎn)胞外多糖乳酸菌資源提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種，植物乳桿菌XN1904E 由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。MRS 肉湯培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂，Biosharp，葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蔗糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS 固體培養(yǎng)基：MRS 肉湯培養(yǎng)基中添加瓊脂15.0 g；MRS-S 液體培養(yǎng)基: MRS 肉湯培養(yǎng)基中的葡萄糖20 g 改為5 g，再加蔗糖50 g；直投式發(fā)酵劑，北京川秀國(guó)際貿(mào)易有限公司；脫脂乳粉，澳優(yōu)乳業(yè)（中國(guó)）有限公司；濃硫酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（PUCHUN 型），上海精密科學(xué)儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱（GZ-400-S 型），韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；雙人單面垂直凈化工作臺(tái)（SW-CJ-2D 型），蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；超級(jí)恒溫水浴鍋（601 型），金壇市醫(yī)療器廠；冷藏柜（SC-320C 型），青島海爾股份有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀（GCMS-QP2010 型），島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；數(shù)顯黏度計(jì)（NDJ-8S），上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

取-80 ℃保藏的菌種冷藏至室溫后，按5%的接種量接種于裝有250 mL MRS 液體培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中中，37 ℃培養(yǎng)24 h，活化兩代后備用。

1.3.2 產(chǎn)胞外多糖植物乳桿菌（XN1904E）發(fā)酵特性研究

（1）菌種的馴化。

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)：將植物乳桿菌XN1904E 分別接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，得到菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)液。

菌種馴化：將上述活化后菌液按照50%接種量（v/v）接種于10 mL 無(wú)菌的脫脂乳中37 ℃培養(yǎng)24 h，得到接種乳，再按照20%接種量（v/v）將接種乳接入到10 mL無(wú)菌脫脂乳中培養(yǎng)；之后每次馴化按照5%逐漸減少接種乳的添加量，增加無(wú)菌脫脂乳的量，控制總馴化次數(shù)為3～5 次；得到馴化好的菌種，其中菌種的含量控制在107～109CFU/mL[10]。

（2）發(fā)酵乳的制備。

參照方法[11]基礎(chǔ)上有所調(diào)整，12%脫脂復(fù)原乳→預(yù)熱(65～70 ℃)(混合均勻→殺菌(90～95 ℃，10 min) →冷卻(41～43 ℃) →接種各試樣組發(fā)酵劑（復(fù)配組；發(fā)酵劑組；XN1904E 組）接種量為3%→發(fā)酵(41 ℃，pH4.5 為發(fā)酵終點(diǎn)) →冷卻后熟(4～6 ℃放置12 h) →成品待測(cè)。

1.3.3 發(fā)酵乳pH 值和滴定酸的測(cè)定

（1）采用數(shù)顯pH 計(jì)測(cè)定發(fā)酵乳的pH 值。

（2）滴定酸度的測(cè)定：GB 5413.34-2010，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度的測(cè)定[14]。

1.3.4 發(fā)酵乳黏度的測(cè)定

將發(fā)酵乳置于室溫（25 ℃）一段時(shí)間后，采用數(shù)顯黏度測(cè)定儀測(cè)定發(fā)酵乳的黏度，參數(shù)設(shè)定為25 ℃，3#轉(zhuǎn)子進(jìn)行測(cè)定，其中轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速15 r/min、扭矩10%～100%、測(cè)定時(shí)間30 s，每個(gè)樣品平行做3次。

1.3.5 發(fā)酵乳多糖含量的測(cè)定

(1) 樣品處理。準(zhǔn)確吸取1.3.2 -（2）中制備的發(fā)酵乳10 g，加入60 mL 無(wú)水乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，使用旋渦混合器使其充分混合，4 500 r/min 離心5 min，棄去上清液，重復(fù)上述步驟三次得到沉淀，將其放置恒溫干燥箱中低溫（40 ℃）烘干，殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ莸?00 mL，備用。

(2) 樣品多糖含量的測(cè)定。參照的黃承敏等[13]方法，采用苯酚-硫酸法測(cè)定發(fā)酵乳中多糖的含量。

1.3.6 發(fā)酵乳風(fēng)味成分的測(cè)定

采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME-GC-MS）對(duì)1.3.2 -（2）中制備的發(fā)酵乳進(jìn)行風(fēng)味成分分析。

（1）樣品萃取方法。稱取按1.3.1-（2）所制備發(fā)酵劑組、復(fù)合組和XN1904E 組發(fā)酵乳樣品各1 g，分別置于15 mL 萃取瓶，在50 ℃溫度條件下處理30 min,在70 ℃條件下用老化好的萃取頭頂空吸附45 min，再插入GC-MS 進(jìn)樣口解吸1 min，拔出萃取頭進(jìn)行GC-MS分析。

（2）GC 條件。 DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱（30 m 色譜柱（行萃取，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；柱箱升溫程序：初溫35 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min 的速度升溫至200 ℃，再以20 ℃/min 的速度升溫至最終溫度250 ℃，保持5 min；載氣為氦氣He，流速為1 mL/min；進(jìn)樣采用自動(dòng)分流方式進(jìn)行，分流比10:1[12]。

（3）MS 條件。EM 電離源，離子源溫度為250 ℃；接口溫度為200 ℃；檢測(cè)電壓為1kV；質(zhì)量掃描范圍m/z為35～400。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著水平P＜0.05，并以O(shè)rigin Pro 2018統(tǒng)計(jì)軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵特性測(cè)定結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵乳pH 值的測(cè)定結(jié)果

三組發(fā)酵牛乳的pH 變化情況見(jiàn)圖1。三組發(fā)酵乳起始pH 基本相同，均在6.50 左右。在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵劑組和復(fù)配組發(fā)酵乳樣品的pH 值均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降（P＜0.05），9 h 時(shí)發(fā)酵劑組和復(fù)配組的pH 分別達(dá)到了4.275、4.316。pH 值均降至4.5 以下，達(dá)到發(fā)酵酸乳生產(chǎn)的最終pH 值的要求[16]。9 h 之后發(fā)酵劑組和復(fù)配組發(fā)酵乳樣品的pH 值呈緩慢下降趨勢(shì)。XN1904E 單獨(dú)發(fā)酵組在發(fā)酵9 h 時(shí)的pH 值6.193 ，此時(shí)XN1904E 單獨(dú)發(fā)酵組的酸乳未能達(dá)到酸乳的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明植物乳桿菌XN1904E 在發(fā)酵前期產(chǎn)酸能力弱。然而隨著后熟時(shí)間的延長(zhǎng)，XN1904E發(fā)酵乳呈顯著下降趨勢(shì)，說(shuō)明植物乳桿菌XN1904E在后熟階段產(chǎn)酸能力增強(qiáng)，可能是發(fā)酵前期植物乳桿菌XN1904E 生長(zhǎng)繁殖緩慢導(dǎo)致分泌的有機(jī)酸較少。

圖1 發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化

2.1.2 發(fā)酵乳滴定酸的測(cè)定結(jié)果

滴定酸度能夠反映發(fā)酵乳中的酸性物質(zhì)可能產(chǎn)生的全部氫離子的總量，因此，研究滴定酸度可更好的了解不同發(fā)酵條件下的發(fā)酵乳的產(chǎn)酸情況[14]。由圖2 可知，滴定酸度與pH 值的結(jié)果一致，發(fā)酵9 h 后發(fā)酵劑組和復(fù)配組發(fā)酵乳樣品的滴定酸分別為77.731oT、79.085oT ，此時(shí)兩組的滴定酸度都超過(guò)了70oT，均達(dá)到乳酸菌發(fā)酵乳生產(chǎn)的最終酸度要求[16]，而此時(shí)菌株XN1904E 單獨(dú)發(fā)酵的酸度僅為24.889oT。且24 h時(shí)，復(fù)配組發(fā)酵乳樣品的滴定酸比發(fā)酵劑組高7.4%，可能是植物乳桿菌XN1904E 產(chǎn)生胞外多糖可促進(jìn)直投式發(fā)酵劑利用糖類轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸[15]。

圖2 發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中滴定酸的變化

2.1.3 發(fā)酵乳黏度的測(cè)定結(jié)果

各發(fā)酵乳的黏度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。，在發(fā)酵過(guò)程中，0～3 h 三個(gè)組別的發(fā)酵乳樣品的黏度無(wú)顯著變化，可能是發(fā)酵前期，菌種的生長(zhǎng)速率較慢，導(dǎo)致發(fā)酵前期發(fā)酵乳的黏度沒(méi)有變化；在3～12 h 過(guò)程中，發(fā)酵劑組和復(fù)配組發(fā)酵乳樣品的黏度迅速上升，且XN1904E 組發(fā)酵乳樣品的黏度仍維持不變，此發(fā)酵階段（3～12 h）植物乳桿菌XN1904E 單獨(dú)發(fā)酵組r仍未出現(xiàn)凝乳現(xiàn)象，說(shuō)明在發(fā)酵前期植物乳桿菌XN1904E單獨(dú)發(fā)酵的凝乳效果較差。而在12～24 h 過(guò)程中，XN1904E 組發(fā)酵乳樣品的黏度呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），又復(fù)配組發(fā)酵乳樣品的黏度比發(fā)酵劑組高13.6%，復(fù)配組黏度最大高達(dá)18320.000 mPa·s。可能是因?yàn)橹参锶闂U菌XN1904E 后期迅速繁殖，其產(chǎn)生胞外多糖增加發(fā)酵乳的黏度[17]。

圖3 發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中黏度的變化

2.2 植物乳桿菌（XN1904E）發(fā)酵乳多糖含量的結(jié)果

各發(fā)酵乳的多糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4 可知，發(fā)酵劑組、XN1904E組和復(fù)配組三組發(fā)酵前脫脂乳中多糖含量分別為378.542 μg/mL、626.167 μg/mL、370.127 μg/mL。在發(fā)酵完成后，發(fā)酵劑組發(fā)酵乳樣品中的多糖含量下降了90.873 μg/mL，XN1904E 組和復(fù)配組發(fā)酵乳中多糖含量分別上升了180.617 μg/mL、46.288 μg/mL。加入菌株XN1904E 后，發(fā)酵乳中的多糖含量明顯增加，此結(jié)果與添加菌株XN1904E 后黏度顯著上升相結(jié)合，說(shuō)明植物乳桿菌XN1904E 迅速繁殖，產(chǎn)生大量的胞外多糖可以改善發(fā)酵乳的黏度和組織結(jié)構(gòu)，減少乳清析出[18]。

圖4 植物乳桿菌（XN1904E）對(duì)發(fā)酵乳產(chǎn)糖含量的影響

2.3 植物乳桿菌（XN1904E）發(fā)酵乳風(fēng)味成分的結(jié)果

各發(fā)酵牛乳組的揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1的結(jié)果可知，發(fā)酵乳的風(fēng)味成分種類繁多。復(fù)配組發(fā)酵乳共有揮發(fā)性成分35種，其中醛類9種，酮類6種，烷烴類6種只來(lái)5種，醇類6種，其他3種。發(fā)酵劑組發(fā)酵乳共測(cè)得揮發(fā)性成分29種，其中醛類8種，酮類4種，烷烴類6 種，酯類4 種，醇類4 種，其他3 種。XN1904E組發(fā)酵乳測(cè)得揮發(fā)性成分30種，其中醛類10種，酮類3種，烷烴類6種，酯類3種，醇類4種，其他4種。

（1）醛類化合物。醛類化合物在酸奶發(fā)酵過(guò)程中屬于過(guò)渡態(tài)化合物，會(huì)被迅速還原生成伯醇或被氧化生成相應(yīng)的酸[19]。從表1 中可以看出，發(fā)酵前，發(fā)酵劑組和復(fù)配組的醛類物質(zhì)基本相同，主要物質(zhì)有壬醛、癸醛、2-甲基烯醛、正十五碳醛、十六醛、2,4-二甲基苯甲醛，XN1904E 組只有壬醛、癸醛、庚醛三種醛類物質(zhì)。壬醛主要來(lái)自于不飽和脂肪酸，是由中間態(tài)的過(guò)氧化物產(chǎn)生的，具有玫瑰、柑橘等香氣[20]。發(fā)酵24 h后，三組醛類風(fēng)味物質(zhì)種類明顯增加，尤其是XN1904E 組醛類物質(zhì)增加到10 種，且壬醛、癸醛、十六醛、2,4-二甲基苯甲醛相對(duì)含量分別13.259%、13.684%、21.952%、2.474%。與發(fā)酵前脫脂乳相比，更加豐富了發(fā)酵乳的香味。

（2）酮類化合物。酮類酮類化合物風(fēng)味獨(dú)特，閾值低，乳制品中最重要的揮發(fā)性物質(zhì)是甲基酮類物質(zhì)，它們會(huì)賦予發(fā)酵乳奶水果、花香等香氣風(fēng)味物質(zhì)[21]。發(fā)酵前，發(fā)酵劑組和復(fù)配組酮類物質(zhì)基本相似，且XN1904E 組酮類物質(zhì)只有2,3-庚烷二酮，且相對(duì)含量只有0.322%。發(fā)酵后，發(fā)酵劑組的酮類物質(zhì)種類無(wú)變化，而復(fù)配組和XN1904E 組的酮類物質(zhì)明顯增多。這可能是植物乳桿菌XN1904E 發(fā)酵后代謝產(chǎn)生[22]。

（3）酯類化合物。酯類化合物是一種很重要的風(fēng)味物質(zhì)，脂肪是酸奶酯類的主要來(lái)源，主要是通過(guò)脂肪酸水解和微生物代謝產(chǎn)生, 尤其是中短鏈脂肪酸水解產(chǎn)生的甲基酮和內(nèi)酯對(duì)酸奶風(fēng)味產(chǎn)生影響[23]。發(fā)酵前，發(fā)酵劑組、復(fù)配組和XN1904E 組都只檢測(cè)出一種酯類為鄰苯二甲酸二丁酯。發(fā)酵后，復(fù)配組的酯類物質(zhì)增加到5 種，分別為苯乙醇乙酸酯、鄰苯二甲酸酯、順式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯、二十六烷酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯。發(fā)酵劑組的酯類物質(zhì)增加到4 種，XN1904E 組也有三種，這可能是微生物代謝產(chǎn)生。

（4）醇類化合物。醇類化合物是乳品中比較普遍存在的風(fēng)味物質(zhì)，它主要是由脂肪酸氧化酶作用于多不飽和脂肪酸衍生而來(lái)的[24]。醇類物質(zhì)雖然對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，但是醇類可以轉(zhuǎn)化胃酸。發(fā)酵前，脫脂乳中都沒(méi)有醇類化合物。發(fā)酵后，三組醇類化合物都有所增加，豐富的醇類物質(zhì)使發(fā)酵酸奶能表現(xiàn)出典型的醇香味。

表1 不同樣品中揮發(fā)性成分

（續(xù)表1）

3 結(jié) 論

對(duì)發(fā)酵劑組、復(fù)合組和XN1904E 組的pH、滴定酸、黏度、多糖含量和風(fēng)味成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)酵乳的pH 和滴定酸的結(jié)果基本一致，發(fā)酵劑組、復(fù)合組在發(fā)酵9 h 后，pH 分別為4.275、4.316；發(fā)酵劑組、復(fù)合組在發(fā)酵9 h 后，滴定酸分別為77.731oT、79.085oT，但XN1904E 組的pH 和滴定酸都未能達(dá)到發(fā)酵乳的要求[16]，說(shuō)明植物乳桿菌XN1904E在發(fā)酵前期產(chǎn)酸能力不強(qiáng)；又復(fù)配組發(fā)酵乳樣品的黏度明顯高于發(fā)酵劑組和XN1904E 組，復(fù)配組黏度最大高達(dá)18320.000 mPa·s。發(fā)酵劑組發(fā)酵乳樣品中的多糖含量下降了90.873 μg/mL，XN1904E 組和復(fù)配組發(fā)酵乳中多糖含量分別上升了180.617 μg/mL、46.288 μg/mL，說(shuō)明植物乳桿菌XN1904E 產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)發(fā)酵乳的黏度有很大的影響。與發(fā)酵前脫脂乳相比，復(fù)合組風(fēng)味物質(zhì)的種類增加至35 種，分別比發(fā)酵劑組和XN1904E 組多6 種和4種，醛類物質(zhì)的相對(duì)含量減少了15.793%，而酮類、烴類、酯類和醇類風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量都有所增加，更加豐富了發(fā)酵乳的香味。