安 雨，劉雅潔，邢國剛，金滋潤2，，西 珂2，，霍涌瑋，趙百孝

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029；2. 北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所 北京 100191；3. 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物系 北京 100191；4. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系 西安 710061；5. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

弱精子癥（Asthenozoospermia）是引起男性不育癥的常見病因之一，以精子活力下降為主要表現(xiàn)[1]，弱精子癥患者的精液參數(shù)指標(biāo)表現(xiàn)為快速前向運動的精子比例與慢速前向運動的精子比例之和，即A+B 級精子數(shù)小于50%，或A級精子數(shù)小于25%[2]。隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，多種多樣的污染增加，生活、工作壓力大，以及隨之而來的生育年齡的推遲，不育癥的發(fā)病率越來越高[3-4]。流行病學(xué)顯示，全球有10%-15%的適齡夫妻被不育癥困擾，其中男性因素占到了50%[5]。目前，中西醫(yī)針對弱精子癥的研究取得了一定成效，但還是有部分患者的療效不能令人滿意[6]，治療弱精子癥還需要更加多樣、有效的方法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，臨床診室濃度的艾煙，對正常Wistar大鼠的生殖機能不僅無害而且還有促進作用[7]，具體表現(xiàn)為可以提高大鼠的精子濃度、精子活力、精子活率，提高大鼠血清總睪酮、游離睪酮、睪酮分泌指數(shù)。本研究擬使用生殖毒性藥物奧硝唑灌胃建立弱精子癥大鼠模型，觀察艾煙對弱精子癥模型大鼠生殖方面的影響，以達到為治療男性弱精子癥提供新思路的目的。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

奧硝唑（北京華威銳科化工有限公司），羧甲基纖維素鈉（百奧百樂生物科技有限公司），普通清艾條（長20 cm，直徑2 cm，湖北李時珍中藥飲片有限公司），市售香煙（雙喜牌，焦油含量11 mg/支），玻璃缸（自制，80 cm× 80 cm × 60 cm，玻璃壁上設(shè)有硬幣大小的圓孔），光散射式數(shù)字粉塵測試儀（北京賓達綠創(chuàng)科技有限公司），精子計數(shù)板（南寧松景天倫生物科技有限公司），水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器有限公司），計算機輔助精子分析系統(tǒng)（北京偉力新世紀科技發(fā)展有限公司，型號：WLJY-9000），普通光學(xué)顯微鏡，臺式冷凍離心機（型號：5417R，eppendorf）。睪酮（T）及促黃體生成素（LH）Elisa試劑盒（北京百諾威生物科技有限公司）。

1.2 動物分組、實驗

32 只成年雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200-230 g ，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0006。將大鼠按體重隨機分為4組：溶劑對照組（vehicle 組）8 只、模型組（ORN 組）8 只、艾煙治療組（ORN+MS組）8只、香煙對照組（ORN+CS組）8只。適應(yīng)飼養(yǎng)7天，期間大鼠均自由食水，每天換水，兩天換一次墊料，保持鼠籠清潔干燥。飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在22℃±2℃，相對濕度50%-60%，保持光照12h（8:00-20:00）和黑暗12h（20:00-次日8:00）交替。

制備奧硝唑溶液：先配制0.2%羧甲基纖維素鈉溶液：0.2 g羧甲基纖維素鈉，加100 mL滅菌雙蒸水，同時加兩滴100 μL Tween-20，攪拌均勻后即可；再將0.25 g奧硝唑加1 mL的0.2%羧甲基纖維素鈉溶液，置于干凈研缽中研碎至糊狀，奧硝唑溶液配制完成。

模型組、艾煙組、香煙組：每組均使用奧硝唑溶液灌胃，每次400 mg/kg，每日1次，連續(xù)灌胃10天。從第11 天起，將三個組的奧硝唑劑量調(diào)至200 mg/kg，每日1 次，并開始艾煙和香煙干預(yù)，每天20 min，每日1 次，每周6天。實驗共8周。

溶劑對照組：只給與等體積的0.2%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，每日1次，共灌胃8周，不進行其他干預(yù)。

艾煙濃度的控制：先用粉塵測試儀測量京津地區(qū)夏季臨床艾灸場所PM10 濃度，再將艾條通過圓孔插入玻璃缸內(nèi)，再用該粉塵儀檢測玻璃缸中艾煙，當(dāng)濃度達到3倍臨床艾煙濃度時，將一整組大鼠連同鼠籠一起放入玻璃缸干預(yù)。香煙濃度與艾煙濃度保持一致。

1.3 標(biāo)本采集與檢測

各組大鼠在治療結(jié)束后24h，用水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血，放血處死實驗動物，并迅速摘取睪丸、附睪，備用。

血液標(biāo)本采用ELISA 法，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

采用擴散法收集附睪尾中的精子進行精子參數(shù)分析[8]。將2 mL 的0.9%氯化鈉溶液倒入標(biāo)記好的一次性培養(yǎng)皿中，37℃水浴預(yù)熱，將雙側(cè)附睪尾放入其中，用剪刀在附睪尾輕輕地剪3刀，在37℃水浴鍋中放置2 min，輕輕混勻，取20 μL 液體加到37℃預(yù)熱的精子計數(shù)板上，隨機選6 個視野，2 min 內(nèi)完成測試。使用計算機輔助精子分析系統(tǒng)檢測精液主要指標(biāo)精子密度、精子活力、精子活率、A 級精子數(shù)、A + B 級精子數(shù)。

1.4 睪丸組織形態(tài)

取大鼠睪丸組織，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片厚5 μm，貼于載玻片上，室溫干燥。常規(guī)HE染色后，光鏡下觀察照相。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果用SPSS 20.2 統(tǒng)計軟件分析。所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，對符合正態(tài)性分布且方差齊的計量數(shù)據(jù)采用（xˉ±s）表示，用單因素方差分析ANOVA 法進行分析，若組間數(shù)據(jù)有顯著性差異，再用LSD 法進行組間多重比較。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艾煙可明顯提高弱精子癥模型大鼠的精子質(zhì)量

與溶劑對照組相比，模型組大鼠的精子質(zhì)量明顯下降，包括精子活力、精子活率、A 級精子數(shù)、A+B 級精子數(shù)均顯著下降（P ＜0.01），這表明弱精子癥大鼠模型建立成功。

表1 艾煙對弱精子癥模型大鼠精子參數(shù)的影響

圖1 睪丸組織200鏡下

給予艾煙干預(yù)后，弱精子癥模型大鼠精子的各項指標(biāo)均有顯著改善（見表1），具體表現(xiàn)為：與模型組相比，艾煙組大鼠的精子活力、精子活率、A 級精子數(shù)和A+B 級精子數(shù)明顯提高（P ＜0.01）；與溶劑組相比，艾煙組的精子活力、精子活率、A級精子數(shù)、A+B級精子數(shù)無差異（P ＞0.05）。

香煙對照組大鼠的精子質(zhì)量產(chǎn)生了意料之外的變化，表現(xiàn)為：與溶劑組和艾煙組相比，香煙組的精子活力、精子活率、A級精子數(shù)、A+B級精子數(shù)顯著低下（P ＜0.01），但與模型組相比，香煙組的精子活力、精子活率、A+B級精子數(shù)有所回升（P ＜0.05）。

四個組之間的精子密度無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞0.05）。

2.2 艾煙可調(diào)節(jié)大鼠血清睪酮、促黃體生成素水平（nmol/L）

與溶劑對照組相比，模型組和香煙組大鼠的血清睪酮的含量顯著下降（P ＜0.01）、促黃體生成素的含量上升（P ＜0.01）；給予艾煙干預(yù)后，艾煙組與模型組相比，睪酮的含量上升（P ＜0.01）、促黃體生成素的含量下降（P ＜0.05），而香煙組沒有改善，效果明顯低于艾煙組（P ＜0.01）（見表2）。

2.3 大鼠睪丸組織的形態(tài)學(xué)變化

由圖1可以看出，溶劑對照組大鼠睪丸組織中，生精小管排列緊密、間隙緊湊，生精小管的生精上皮細胞完整，基底膜厚度均勻，各級生精細胞排列整齊且層次清晰，管腔內(nèi)精子豐富。模型組大鼠睪丸組織中，各個生精小管間的間隙增大，生精小管管腔擴大，基底膜變薄，生精細胞的層次混亂，無法清楚分級，管腔內(nèi)的精子數(shù)量明顯減少。給予艾煙干預(yù)后，生精小管的排列相對緊密，管腔也有所縮小，生精上皮和基底膜的厚度增加，各級生精細胞的排列層次也有恢復(fù)，管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯增加，與溶劑對照組相比還存在一定的差距。香煙組的病變程度比模型組更重一些，表現(xiàn)為生精小管的排列更為稀疏，生精小管的管腔也更大，基底膜更薄，各級生精細胞的數(shù)量顯著減少。

表2 艾煙對弱精子癥模型大鼠血清睪酮、促黃體生成素含量的影響

3 討論

弱精子癥屬于中醫(yī)學(xué)的“精冷”范圍，病機多為腎虛。其發(fā)病原因和機制較為復(fù)雜[9-10]，染色體異常、微生物感染、內(nèi)分泌紊亂、精索靜脈曲張及自身免疫等因素是弱精子癥較明確的病因，氧化應(yīng)激和細胞凋亡是其較明確的發(fā)病機制。

成功建立弱精子癥動物模型，是探索弱精子癥新療法和機制的前提。在臨床上，奧硝唑被廣泛用于防治術(shù)后感染和生殖系統(tǒng)感染[11]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，奧硝唑可以影響附睪中精子的成熟和運動，從而導(dǎo)致雄性動物不育且這種影響是可逆的[12]，這一點正是造模的基礎(chǔ)，并且需要在造模成功后，不間斷給藥以維持模型的弱精子效果。有研究[13]每天用400 mg/kg 的劑量灌胃造模；也有研究[14]每天用200 mg/kg 的劑量造模。考慮到本實驗中造模及干預(yù)時間長，所以前10天用400 mg/kg，從第11 天開始，將奧硝唑的劑量減半。本實驗中的模型組與溶劑組相比，精子參數(shù)明顯下降，睪丸生精小管管腔擴大，小管之間間隙增大，生精細胞層次排列紊亂，管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少，其造模效果與之前的研究相似，說明弱精子癥模型制備成功。

艾灸是中醫(yī)常用的療法之一，國內(nèi)外的臨床研究表明灸法治療弱精子癥療效確切，包括麥粒灸[15]、艾條灸[16]、臍灸[17]；機制研究[18]也發(fā)現(xiàn)，艾灸可以改善弱精子癥大鼠精子質(zhì)量，可能與灸法的溫?zé)岽碳つ苷{(diào)節(jié)性激素T、LH、FSH 水平和細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、CytC 水平有關(guān)。艾灸通過清除自由基抗氧化[19-21]和抑制細胞凋亡[22-25]這兩大途徑，能治療包括弱精子癥在內(nèi)的多種疾病。

艾灸的起效途徑[26]主要包括溫?zé)嵝?yīng)、光輻射、艾煙等。對艾葉成分的研究[27]發(fā)現(xiàn)，艾葉中富含揮發(fā)油（如桉油精、松油醇、1,8-桉葉油素）、黃酮（如黃酮醇及其苷）等物質(zhì)，燃燒后產(chǎn)生的艾煙可以抗氧化[20]，抗神經(jīng)元凋亡[28]，抗炎性反應(yīng)[29]，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[30]。由此可以提出假說，艾煙能通過從抗氧化應(yīng)激和抗細胞凋亡的途徑治療弱精子癥，下一步的研究應(yīng)著眼于這兩方面指標(biāo)的變化。此外，艾煙作用于人體主要是經(jīng)過嗅覺系統(tǒng)，這與中醫(yī)的芳香療法密切相關(guān)，氣味可能刺激嗅覺神經(jīng)和大腦邊緣系統(tǒng)，今后也可以考慮切斷嗅覺通路[31]，來觀察艾煙對弱精子癥的療效。

精子密度、精子活力、精子活率、A 級精子數(shù)、A+B級精子數(shù)等必備指標(biāo)常用于評價以下四個方面：男性生育能力和精子的質(zhì)量、睪丸組織的損害程度、精子的發(fā)生功能、觀測雄鼠的生殖功能[18]。本實驗中，與溶劑對照組相比，模型組大鼠的精子活力、精子活率、A級精子數(shù)、A+B 級精子數(shù)均顯著降低（P ＜0.01）；經(jīng)過艾煙干預(yù)后，艾煙組大鼠的這些指標(biāo)均升高（P ＜0.01），這說明艾煙能明顯改善奧硝唑誘導(dǎo)的弱精子癥模型大鼠的精液質(zhì)量。這與本課題組的前期研究[7]相一致。

精子的產(chǎn)生，在內(nèi)分泌等許多因素下進行，過程較為復(fù)雜，如果睪丸受損，往往表現(xiàn)為睪酮（T）的降低和促黃體生成素（LH）的升高[18]，T/LH 的比值也是衡量患者睪丸生精水平的重要參考指標(biāo)[32]。因此，血清性激素T 和LH 的水平可以反映精子的發(fā)生的情況。本實驗中，與溶劑組相比，模型組大鼠的T 降低而LH 升高（P ＜0.01），經(jīng)過艾煙干預(yù)后，艾煙組大鼠的T 升高（P ＜0.01）、LH 降低（P ＜0.05），激素水平得到顯著改善。

香煙煙霧以尼古丁為主，是一種氧化劑，可直接造成生殖系統(tǒng)的氧化應(yīng)激損傷[33]，嚴重影響精液質(zhì)量，也會抑制睪酮的合成[34]，本實驗的血清激素和病理結(jié)果證實了其副作用。雖然香煙提高了精子活力、活率、A+B 級精子數(shù)，但沒有提高A 級精子數(shù)，更遠遠沒有達到像艾煙組一樣的效果，前人也有類似的發(fā)現(xiàn)[35]：吸煙6 周后小鼠的精子活力沒有下降反而有上升趨勢。由于香煙對生殖系統(tǒng)的損傷存在時長和劑量的依賴性[36]，所以本課題組猜測，香煙的刺激提高了機體的興奮性，類似于尼古丁促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)對信息的處理[37-38]。

本實驗的量-效關(guān)系、時-效關(guān)系還可進一步完善，如提高艾煙的濃度、設(shè)置不同濃度的分組，延長或縮短單次艾煙干預(yù)的時長，以尋找最佳濃度和最佳干預(yù)時長。

綜上所述，本課題組得出結(jié)論：艾煙可以提高弱精子癥模型大鼠的精子質(zhì)量，提高精子活力、精子活率、A級精子數(shù)、A+B級精子數(shù)；提高弱精子癥模型大鼠血清睪酮水平、降低促黃體生成素水平；減輕弱精子癥模型大鼠睪丸的病變；從而保護弱精子癥模型大鼠的生殖功能，對臨床弱精子癥患者的治療具有一定的參考價值。