劉 玲，孫玉梅

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034）

生物表面活性劑是微生物通過發(fā)酵產(chǎn)生的表面活性化合物，其生產(chǎn)菌株主要為細(xì)菌、真菌和酵母菌，研究較多的有假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、不動桿菌屬（Acinetobacterspp.）、紅球菌屬（Rhodococ cusspp.）等，而有關(guān)蒼白桿菌屬（Ochrobactrumspp.）的研究較少。生物表面活性劑按結(jié)構(gòu)可大致分為糖脂、脂肽或脂蛋白、磷脂及中性脂衍生物等[1]。與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑具有環(huán)境友好性和可生物降解性等優(yōu)點(diǎn)，但其實(shí)際生產(chǎn)受諸多因素的影響，其中最為突出的是生產(chǎn)成本高。目前，已有大量研究對生物表面活性劑的上游發(fā)酵過程進(jìn)行了優(yōu)化[2]，但對下游加工過程進(jìn)行優(yōu)化的研究卻很少，并且下游加工成本約占總生產(chǎn)成本的60%～80%[3]，因此生物表面活性劑的下游加工尤為重要。下游加工面臨的主要難題包括培養(yǎng)基、產(chǎn)物及其同系物的復(fù)雜性，不同培養(yǎng)基和產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性未知或不明確以及發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度低等[4]。

目前從發(fā)酵液中提取生物表面活性劑的方法有很多，如酸沉法、溶劑萃取法、有機(jī)溶劑沉淀法、超濾法、泡沫分餾法、吸附法和色譜法等，但并不具有一定的規(guī)律，必須由產(chǎn)物的性質(zhì)而定[5]。在這些方法中最常用的為前三種，并且酸沉法與溶劑萃取法通常結(jié)合使用。將酸沉法與氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）萃取[6]、無水乙醚萃取[7]以及乙酸乙酯萃取[8]結(jié)合均可用于脂肽類生物表面活性劑的提取。將酸沉法與乙酸乙酯萃取法結(jié)合，還可用來提取糖脂類生物表面活性劑[9]及4-二甲基氨基苯甲醛（4-（dimethylamino）benzaldehyde）[10]。對于生物乳化劑的提取，較多的是采用有機(jī)溶劑沉淀法。ZARINVIARSAGH M等[11]采用冷乙醇沉淀法提取中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）MZV101所產(chǎn)生物乳化劑，提取率為49.32%，提取產(chǎn)物乳化活性可達(dá)70.99%，冷丙酮沉淀法提取產(chǎn)物的提取率和乳化活性分別為38.21%和62.87%，硫酸銨提取效果略低于冷丙酮，而異丙醇無提取效果。于人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi）MP3的發(fā)酵液中加入3倍體積冷乙醇，能提取得到對柴油、煤油和葵花油都有良好乳化活性的產(chǎn)物[12]。于不動桿菌（Acinetobacter）發(fā)酵液中加入3倍體積冷乙醇進(jìn)行提取，亦可得到具有良好乳化活性的生物乳化劑[13]。

本研究采用了調(diào)pH法、溶劑萃取法和沉淀法對蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）所產(chǎn)生物表面活性劑進(jìn)行提取，從提取效率和產(chǎn)物活性兩方面對提取效果進(jìn)行評估，并研究調(diào)pH法與乙醇沉淀法結(jié)合對生物表面活性劑提取效果的影響，為進(jìn)一步提高分離效果和產(chǎn)物純度奠定基礎(chǔ)和提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）：由大連工業(yè)大學(xué)生物催化技術(shù)國家與地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并在20%甘油管中于-80 ℃保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；NaCl、蔗糖、硝酸鈉、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、無水乙醚、丙酮、體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇、液體石蠟（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；F254硅膠板：德國Merck公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：NaCl 15 g/L，牛肉膏5 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，調(diào)pH 至7.0，115 ℃濕熱滅菌30 min。

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L，硝酸鈉4 g/L，KH2PO43.4 g/L，Na2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，酵母浸粉0.2 g/L，調(diào)pH至7.0，115 ℃濕熱滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型精密pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-5200型分光光度計：上海元析儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；LYO QUEST-85真空冷凍干燥儀：西班牙Telstar公司；H1750R離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器：金壇市金城翔龍儀器廠；DNP-9082型恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZWY-C211D型臥式旋轉(zhuǎn)式恒溫恒濕搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液及發(fā)酵液的制備

取一環(huán)-80 ℃甘油管中保存的蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）涂布于新鮮斜面上，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h后取一環(huán)菌涂布于另一新鮮斜面上，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h得到活化菌種。取2環(huán)活化菌種接入種子培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h得到種子液。以8%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)5 d得到發(fā)酵液。

1.3.2 不同方法對生物表面活性劑的提取

將發(fā)酵液離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），得到發(fā)酵上清液，并對發(fā)酵上清液分別采用調(diào)pH法、有機(jī)溶劑萃取法、有機(jī)溶劑沉淀法及調(diào)pH法結(jié)合乙醇沉淀法進(jìn)行生物表面活性劑的提取。

調(diào)pH法：用6 mol/L HCl和6 mol/L NaOH將發(fā)酵上清液的pH分別調(diào)至1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、13.0、14.0，4 ℃靜置14 h，離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），分離上清液和沉淀，沉淀冷凍干燥后稱質(zhì)量，將干燥的沉淀重溶于原始發(fā)酵液1/5體積的去離子水中進(jìn)行乳化活性測定。

有機(jī)溶劑萃取法：向發(fā)酵上清液中分別加入2倍體積的氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）、乙酸乙酯和乙醚進(jìn)行萃取，分離有機(jī)相和水相，測定水相的乳化活性及成分組成。

有機(jī)溶劑沉淀法：向發(fā)酵上清液中分別加入2倍體積的冷丙酮、冷乙醇和冷甲醇（-20 ℃過夜預(yù)冷），4 ℃靜置14 h。離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），沉淀揮發(fā)除去有機(jī)溶劑后冷凍干燥，稱質(zhì)量并用去離子水溶解至原體積，測定乳化活性及成分組成。

調(diào)pH法結(jié)合乙醇沉淀法：將發(fā)酵原液、調(diào)發(fā)酵液pH至13除去沉淀溶液、調(diào)發(fā)酵液pH至13除去沉淀后，上清液調(diào)至原始pH溶液作為樣液，分別向上述3種不同處理樣液中加入2倍和3倍體積的冷乙醇，500 r/min冰浴攪拌10 min，于4 ℃靜置沉淀14 h后，離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），沉淀揮發(fā)除去乙醇后冷凍干燥，稱質(zhì)量并用去離子水溶解至原體積，測定乳化活性及成分組成。

1.3.3 分析檢測

乳化活性：取1.5 mL樣品，加入0.9 g液體石蠟，手動搖勻150次，靜置24 h，乳化層高度占總液層高度的百分比即為乳化活性；采用3,5-二硝基水楊酸法[14]測定水解后樣品中的總糖含量；采用國標(biāo)GB/T 5534—2008《動植物油脂皂化值的測定》[15]測定樣品中的脂肪酸含量；采用考馬斯亮藍(lán)法[16]測定樣品中的蛋白含量；采用薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法[17]測定生物表面活性劑的組成成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)pH法對生物表面活性劑的提取

將發(fā)酵液pH值調(diào)至1～14，發(fā)現(xiàn)pH值1～12均無沉淀產(chǎn)生，而在pH值為13和pH值為14產(chǎn)生少量沉淀，將沉淀溶解于原提取發(fā)酵液1/5體積的去離子水中，對其進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見表1。

由表1可知，沉淀主要成分為糖、脂肪酸和磷酸鹽及少量蛋白質(zhì)，將沉淀溶解于原提取發(fā)酵液1/5體積的去離子水中，pH值為13沉淀（pH值為13時所產(chǎn)沉淀溶解于原提取發(fā)酵液1/5體積的去離子水中后，溶液中沉淀的質(zhì)量濃度1.83 g/L）無乳化活性，pH值為14沉淀（pH值為14時所產(chǎn)沉淀溶解于原提取發(fā)酵液1/5體積的去離子水中后，溶液中沉淀的質(zhì)量濃度1.40 g/L）表現(xiàn)出較小的乳化活性。

表1 發(fā)酵液在pH 13和pH 14所產(chǎn)沉淀的量、乳化活性和組成Table 1 Amount,emulsifying activity and composition of precipitate produced in fermentation broth at pH 13 and pH 14

將發(fā)酵上清液調(diào)pH 2進(jìn)行酸沉淀是生物表面活性劑最常用的提取方法，但在本研究中發(fā)酵液pH值調(diào)至1～2時均無沉淀產(chǎn)生，調(diào)至pH 13以上所產(chǎn)沉淀乳化活性也較低，因此通過調(diào)pH法不能用于提取該生物表面活性劑。有文獻(xiàn)報道，將發(fā)酵液pH調(diào)至2有沉淀產(chǎn)生的為脂肽或脂蛋白類表面活性劑，無沉淀的則為糖脂類表面活性劑[18-19]，由此初步推測該菌株所產(chǎn)物質(zhì)可能為糖脂類生物表面活性劑。

2.2 有機(jī)溶劑萃取法對生物表面活性劑的提取

有機(jī)溶劑萃取法是生物表面活性劑提取的常用方法，常用的溶劑有氯仿、甲醇、乙醚、乙酸乙酯等，其中氯仿和甲醇通常以不同比例混合使用[5]。發(fā)酵液通過乙酸乙酯、無水乙醚及氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）萃取后，測定水相的乳化活性及成分組成，結(jié)果見表2。

由表2可知，通過乙酸乙酯、無水乙醚及氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）萃取后，水相中糖、脂肪酸、蛋白質(zhì)和磷酸鹽殘留均很大，且水相中乳化活性仍然較高，說明這幾種溶劑不能有效地萃取出生物乳化劑。這幾種方法中，乙酸乙酯對總糖的提取率較高，氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）對蛋白質(zhì)的提取率較高，無水乙醚對脂肪酸的提取率更高，三種方法對磷酸鹽提取率幾乎相同。

表2 有機(jī)溶劑萃取后水相的乳化活性及組成Table 2 Emulsifying activity and composition of aqueous phase after organic solvent extraction

2.3 有機(jī)溶劑沉淀法對生物表面活性劑的提取

有機(jī)溶劑主要通過降低溶液的介電常數(shù)以及破壞分子表面水化層來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的沉淀分離[20]。向發(fā)酵上清液中分別加入2倍體積的冷丙酮、冷乙醇和冷甲醇（-20 ℃過夜預(yù)冷），4 ℃靜置14 h，沉淀揮發(fā)除去有機(jī)溶劑后冷凍干燥，稱質(zhì)量并用去離子水溶解至原體積，測定乳化活性及成分組成，結(jié)果見表3。

由表3可知，向發(fā)酵液中加入2倍體積冷甲醇沒有沉淀產(chǎn)生，而加入冷乙醇和冷丙酮有沉淀產(chǎn)生，且丙酮沉淀量略高于乙醇沉淀量。產(chǎn)生這種差異的原因應(yīng)該與三者的介電常數(shù)有關(guān)，三者的介電常數(shù)[20]分別為33、24、22，在加入量相同的情況下，溶劑介電常數(shù)越低則理論上能使更多的物質(zhì)沉淀下來。乙醇沉淀量雖略低于丙酮沉淀量，但其乳化活性高于丙酮沉淀，且與原始發(fā)酵液乳化活性相近。且兩者沉淀下來的物質(zhì)有所不同，乙醇沉淀中總糖和磷酸鹽含量較高，而丙酮沉淀中蛋白質(zhì)和脂肪酸的含量較高。鑒于乙醇沉淀的乳化活性（57.31%）及丙酮的毒性，進(jìn)一步研究采用乙醇沉淀法對生物表面活性劑進(jìn)行提取。

表3 加入有機(jī)溶劑產(chǎn)生沉淀的量、乳化活性和組成Table 3 Amount,emulsifying activity and composition of precipitation produced by adding organic solvents

2.4 調(diào)pH法結(jié)合乙醇沉淀法對生物表面活性劑的提取

分別向不同處理樣液中加入2倍和3倍體積的冷乙醇，500 r/min冰浴攪拌10 min，于4 ℃靜置沉淀14 h后，沉淀揮發(fā)除去乙醇后冷凍干燥，稱質(zhì)量并用去離子水溶解至原體積，測定乳化活性及成分組成，結(jié)果見表4。

由表4可知，采用不同方法提取后所得沉淀均含有少量糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸及大量磷酸鹽。采用將發(fā)酵液pH調(diào)至13除沉淀后再乙醇沉淀，沉淀量顯著高于其他兩種處理方式（P＜0.05）。加入2倍體積冷乙醇時，沉淀量（6.33 g/L）較其余兩種處理方式沉淀量（4.26 g/L、4.74 g/L）分別提高了48.59%和33.54%；加入3倍體積冷乙醇時沉淀量（6.69 g/L）較其余兩種處理方式（4.61 g/L、4.89 g/L）分別提高了45.12%和36.79%。三種處理中加入3倍體積冷乙醇較加入2倍體積冷乙醇的沉淀量分別增加了8.22%、5.69%和3.16%。由此可見，發(fā)酵液的pH比乙醇用量對沉淀效果的影響更大。并且在沉淀質(zhì)量濃度均為3 g/L時，采用后兩種處理方式并加入3倍體積冷乙醇，沉淀乳化活性顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），其值分別為60.00%和59.63%，較直接向原始發(fā)酵液中加入3倍體積冷乙醇進(jìn)行提取相比提取分別提高了50.00%和49.08%。由此推測，在將發(fā)酵液pH調(diào)至13的過程中改變了體系中某些物質(zhì)的溶解性，使得更多的物質(zhì)沉淀了下來。將發(fā)酵液pH值調(diào)至13后加入3倍體積冷乙醇進(jìn)行提取，不僅沉淀量多，而且單位質(zhì)量沉淀的乳化活性也較高，因此認(rèn)為此方法更適合該生物表面活性劑的提取，經(jīng)測定所得沉淀中含有少量糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸以及較多的磷酸鹽，幾種組分的提取率分別為50.29%、80.62%、34.43%和70.42%。

表4 發(fā)酵液調(diào)pH結(jié)合乙醇沉淀的產(chǎn)量、乳化活性和組成Table 4 Amount,emulsifying activity and composition of precipitate by adjusting pH combined with ethanol precipitation of fermentation broth

2.5 生物表面活性劑的組分分析

采用不同方法提取蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）發(fā)酵液生物表面活性劑，并用TLC法測定生物表面活性劑的組成成分，以正丁醇∶乙醇∶水（5∶3∶2，V/V）為展開劑，苯胺-二苯胺-磷酸溶液用于糖顯色，羅丹明用于脂顯色，茚三酮用于蛋白顯色，85 ℃烘烤10 min進(jìn)行顯色，并以培養(yǎng)基中的蔗糖和酵母浸粉以及發(fā)酵液作為標(biāo)品，結(jié)果見圖1。

圖1 不同方法提取的產(chǎn)物薄層層析Fig.1 Thin layer chromatography of products extracted by different methods

由圖1可知，采用不同方法對發(fā)酵液進(jìn)行提取，所得產(chǎn)物均無與蔗糖和酵母浸粉相同的條帶，說明得到的產(chǎn)物不是培養(yǎng)基中殘留的蔗糖和酵母浸粉；發(fā)酵液和所有方法提取得到的產(chǎn)物均在基線處有糖和脂肪酸的顯色，說明提取所得產(chǎn)物分子質(zhì)量可能較大，導(dǎo)致在此展開條件下比移值較低；并且顯色深淺不同，說明不同方法提取得到的產(chǎn)物濃度不同，顯色較深的有發(fā)酵液調(diào)pH 13除沉淀后加入3倍體積乙醇，以及發(fā)酵液調(diào)pH 13除沉淀后回調(diào)至原始pH，再分別加入2倍和3倍體積乙醇所得沉淀，由此推測發(fā)酵液經(jīng)不同處理后再乙醇沉淀提取所得產(chǎn)物均可能是分子質(zhì)量較大的糖脂類生物表面活性劑，只是生物表面活性劑含量不同。文獻(xiàn)報道分子質(zhì)量較大的生物表面活性劑通常具有乳化能力[21]，將發(fā)酵液pH調(diào)至2.0無沉淀產(chǎn)生的為糖脂類表面活性劑[18-19]，這也與該推測相符合，只是該產(chǎn)物中的糖和脂肪酸的含量都較低。不同方法提取后沉淀中生物表面活性劑含量差異應(yīng)該與提取時的pH有關(guān)，表面活性劑是兩性物質(zhì)，親水一端往往都是極性大的酸性或者堿性基團(tuán)，pH的改變必將改變這兩類基團(tuán)的狀態(tài)，從而改變分子正負(fù)電荷比例的狀態(tài)，引起親水親和力強(qiáng)度的改變。特別是當(dāng)分子電荷密度升高，如pH 13時，成鹽形式的帶電荷羧酸根增多，極性增強(qiáng)，加入高濃度的乙醇與水分子混合時，降低了水溶液的極性，析出大量的強(qiáng)極性的兩性表面活性劑。

3 結(jié)論

經(jīng)對比，調(diào)pH法、溶劑萃取法（無水乙醚、乙酸乙酯、氯仿/甲醇）、甲醇沉淀法及丙酮沉淀法均不能有效將該生物表面活性劑提取出來，而乙醇沉淀法可提取出乳化活性很高的生物表面活性劑。將發(fā)酵液pH值調(diào)至13除去沉淀后加入3倍體積冷乙醇提取產(chǎn)量（6.69 g/L）和乳化活性（60.00%）均最高，與直接對原始發(fā)酵液加入3倍體積冷乙醇進(jìn)行提取相比，產(chǎn)量提高了45.12%，乳化活性提高了50.00%，該法可得到分子質(zhì)量較大且含有少量糖、蛋白、脂和較多磷酸鹽的生物表面活性劑。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液的pH比乙醇用量對提取效果影響更大，因此在后續(xù)的研究中可進(jìn)一步探討將發(fā)酵液pH值調(diào)13除雜后回調(diào)至不同pH，再乙醇沉淀對沉淀效果的影響。本研究可為進(jìn)一步提高分離效果和產(chǎn)物純度奠定基礎(chǔ)和提供依據(jù)，也可為不能采用酸沉法提取的生物表面活性劑的提取研究提供參考意見。