張芮瑞，邱樹毅，周少奇，王雪酈，3

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001；3.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

磷是除氮外限制植物生長(zhǎng)的第二營(yíng)養(yǎng)元素，在光合作用等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[1-2]。由于土壤中有效磷的缺乏，速效磷肥被大量使用，而絕大部分的磷肥進(jìn)入土壤后與Ca2+等金屬離子結(jié)合形成Ca3（PO4）2等難溶性磷，難以被植物吸收利用[3-4]。既造成有限磷礦資源大量浪費(fèi)，還加劇農(nóng)業(yè)資源污染問(wèn)題[5]。好氧堆肥法能在一定程度上緩解肥料緊缺和環(huán)境污染方面的壓力，而解磷微生物菌劑的加入，不但可以加快肥料的腐熟，還可以促進(jìn)磷素的轉(zhuǎn)化，提高肥效[6]。

目前，大量的解磷微生物相關(guān)的研究成果已被先后報(bào)道，解磷細(xì)菌主要為假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和洋蔥伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）等[7-11]；解磷真菌主要為青霉屬（Penicillium）、根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）等[12-15]。實(shí)際上，解磷微生物的溶磷過(guò)程極其復(fù)雜，并非其中單一的某一因素起所有作用，而是多種因素共同作用的結(jié)果[16]。有關(guān)解磷微生物溶磷培養(yǎng)條件的優(yōu)化早有研究[10，15]，獲得了大量研究成果。除簡(jiǎn)單的單因素優(yōu)化的研究外，也有采用正交法或者響應(yīng)面法等進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究，從而盡多的探究更多因素對(duì)解磷微生物解磷條件的影響[17-18]。但上述所涉及的研究?jī)?nèi)容基本為非高溫解磷微生物，并不適用于好氧堆肥下的高溫條件。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于耐高溫解磷微生物的研究相對(duì)較少，其中對(duì)耐高溫解磷真菌的研究更為稀缺。

本實(shí)驗(yàn)早期篩選獲得的溶磷效果較好的耐高溫解磷真菌菌株GDF1，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)，調(diào)整碳源、氮源等培養(yǎng)條件，探究解磷菌株解磷效果最佳時(shí)的溶磷條件，以期為GDF1菌株投入高效微生物菌肥的生產(chǎn)提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來(lái)源

耐高溫解磷真菌GDF1為本實(shí)驗(yàn)室從白酒丟糟高溫堆肥樣品中篩選獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)磷發(fā)酵液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，Ca3（PO4）25.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g；蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。其中Ca3（PO4）2需與其他藥品分開滅菌后再混合。

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯浸粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂14 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.8～6.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-CJ-IFD型超凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；THZ-82數(shù)顯恒溫氣浴振蕩器：天津賽得里斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；101-1AB電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；SpectraMax190酶標(biāo)儀：美谷分子儀器有限公司；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋、BMJ-250C培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA-2004N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 解磷能力測(cè)定

將充分活化后的出發(fā)菌株GDF1接種于PDA培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)數(shù)天至菌落布滿整個(gè)平板，加無(wú)菌水洗脫并用脫脂棉過(guò)濾，制備孢子懸浮液，經(jīng)鏡檢孢子量約為1×107CFU/mL。

將孢子懸浮液以1%接種量接入無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，并以1%無(wú)菌水代替1%孢子懸浮液作空白對(duì)照，重復(fù)3次，作為平行。置于50 ℃、180 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)5 d后取出，10 000 r/min條件下離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后采用鉬銻抗比色法[16]測(cè)定發(fā)酵上清液中的磷含量。以波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度值（OD700nm值）（y）為縱坐標(biāo)，溶磷量（x）為橫坐標(biāo)繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鉬銻抗磷標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.300 5x+3×10-6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，通過(guò)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算溶液中有效磷含量，以確定菌株的解磷能力。

1.3.2 解磷條件優(yōu)化

（1）碳氮源種類的優(yōu)化

碳源種類的優(yōu)化：分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖及甘露醇為唯一碳源（10.0 g/L），其他培養(yǎng)基成分不變，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定，探究不同碳源種類對(duì)其解磷能力的影響。

氮源種類的優(yōu)化：分別以硫酸銨、草酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、乙酸銨及氯化銨為唯一氮源（0.5 g/L），其他培養(yǎng)基成分不變，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定，探究不同氮源種類對(duì)其解磷能力的影響。

（2）碳氮源、無(wú)機(jī)鹽及磷源濃度的優(yōu)化

碳源濃度的優(yōu)化：以最優(yōu)種類碳源為唯一碳源，質(zhì)量濃度分別為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L，其他培養(yǎng)基成分不變，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定，探究不同碳源濃度對(duì)其解磷能力的影響。

氮源濃度的優(yōu)化：以最優(yōu)種類氮源為唯一氮源，質(zhì)量濃度分別為0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L，其他培養(yǎng)基成分不變，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定，研究不同氮源濃度對(duì)其解磷能力的影響。

無(wú)機(jī)鹽濃度的優(yōu)化：以NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O及MnSO4·4H2O為無(wú)機(jī)鹽組合，總質(zhì)量濃度分別為0.48 g/L、0.96 g/L、1.44 g/L、1.92 g/L、2.40 g/L，其他培養(yǎng)基成分不變，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定，探究不同無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)其解磷能力的影響。

磷源濃度的優(yōu)化：以磷酸三鈣（Ca3（PO4）2）為唯一磷源，質(zhì)量濃度分別為2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L，其他培養(yǎng)基成分不變，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定，探究不同磷源濃度對(duì)其解磷能力的影響。

（3）響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取碳源質(zhì)量濃度（A）、草酸銨質(zhì)量濃度（B）、無(wú)機(jī)鹽濃度（C）及磷酸三鈣質(zhì)量濃度（D）為自變量，以GDF1的溶磷量為響應(yīng)值，對(duì)其解磷條件進(jìn)行優(yōu)化，利用各因素兩兩交互響應(yīng)面、等高線以及響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行優(yōu)化，找出GDF1出現(xiàn)最大溶磷量所對(duì)應(yīng)各因素的最優(yōu)值，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 溶磷條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for phosphorus-solubilizing conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 碳氮源種類的優(yōu)化

分別以10 g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖及甘露醇作為碳源進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源種類的篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同碳源對(duì)菌株GDF1溶解磷酸三鈣的能力有差異，溶液中有效磷含量大小依次為蔗糖＞葡萄糖＞麥芽糖＞甘露醇＞果糖＞乳糖，GDF1利用蔗糖作為碳源表現(xiàn)出更好的解磷能力，溶磷量為221.76 mg/L。

圖1 碳源（a）和氮源（b）種類對(duì)菌株GDF1溶磷能力的影響Fig.1 Effect of carbon source (a) and nitrogen source (b) type on the phosphorus-solubilizing ability of strain GDF1

分別以0.5 g/L硫酸銨、草酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、乙酸銨及氯化銨作為氮源進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源種類的篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同氮源對(duì)菌株GDF1溶解磷酸三鈣的能力有差異，溶液中有效磷含量大小依次為草酸銨＞硫酸銨＞氯化銨＞硝酸鈉＞乙酸銨＞硝酸銨，GDF1利用草酸銨作為碳源表現(xiàn)出更好的解磷能力，溶磷量為227.46 mg/L。

由以上試驗(yàn)結(jié)果可得，GDF1的解磷培養(yǎng)基中最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為草酸銨。

2.2 碳氮源、無(wú)機(jī)鹽及磷源濃度的優(yōu)化

以蔗糖為唯一碳源，培養(yǎng)基其他成分不變，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定。結(jié)果表明，隨著蔗糖質(zhì)量濃度增加，溶磷量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/L時(shí)，溶磷量最高，為228.33 mg/L。該結(jié)果趨勢(shì)與前人研究結(jié)果類似[19-20]，即不同的解磷微生物各自存在一個(gè)最適碳源濃度，在低于該值的范圍內(nèi)解磷微生物的解磷能力會(huì)隨著碳源濃度的增加而增大，而一旦超過(guò)這個(gè)值，解磷微生物的解磷能力就會(huì)開始逐漸下降。

圖2 蔗糖（a）、草酸銨（b）、無(wú)機(jī)鹽（c）及磷酸三鈣（d）質(zhì)量濃度對(duì)菌株GDF1溶磷能力的影響Fig.2 Effect of sucrose (a),ammonium oxalate (b),inorganic salt (c)and tricalcium phosphate (d) concentration on phosphorussolubilizing ability of strain GDF1

以草酸銨為唯一氮源，培養(yǎng)基其他成分不變，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定。結(jié)果表明，隨著草酸銨濃度增加，溶磷量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 g/L時(shí)，溶磷量最高，為227.83 mg/L。氮源作為培養(yǎng)基組成的重要成分，在合適的濃度下，能促進(jìn)解磷微生物的繁殖生長(zhǎng)，從而加快磷轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，發(fā)酵液中的溶磷量隨之上升，但濃度過(guò)高時(shí)可能培養(yǎng)到后期會(huì)影響培養(yǎng)基的pH值，從而對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，而導(dǎo)致發(fā)酵液中的溶磷量下降。

以NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O及MnSO4·4H2O為無(wú)機(jī)鹽組合，培養(yǎng)基其他成分不變，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定。結(jié)果表明，隨著無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度增加，溶磷量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到0.96 g/L時(shí)，溶磷量最高，為228.32 mg/L。這種趨勢(shì)的出現(xiàn)推測(cè)可能與解磷微生物溶磷機(jī)制中的金屬離子的螯合作用機(jī)制有關(guān)。

以磷酸三鈣為唯一磷源，培養(yǎng)基其他成分不變，進(jìn)行解磷能力的測(cè)定。結(jié)果表明，隨著磷酸三鈣質(zhì)量濃度增加，溶磷量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到10.0g/L時(shí)，溶磷量最高，為237.81 mg/L。該趨勢(shì)可能是由于當(dāng)難溶性磷濃度低的時(shí)候，菌株GDF1可以利用轉(zhuǎn)化的磷原料少，所以發(fā)酵液中的溶磷量較少；隨著磷酸三鈣的增加GDF1可轉(zhuǎn)化的難溶性磷原料增加，發(fā)酵液中的溶磷量也隨之增加并達(dá)到最大值；而當(dāng)磷酸三鈣濃度過(guò)高的時(shí)候，可能會(huì)對(duì)GDF1的生長(zhǎng)繁殖有抑制作用，從而導(dǎo)致發(fā)酵液中的溶磷量下降。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò)蔗糖質(zhì)量濃度（A）、草酸銨質(zhì)量濃度（B）、無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度（C）和磷酸三鈣質(zhì)量濃度（D）進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。以溶磷量（R）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 溶磷條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for phosphorus-solubilizing conditions optimization

續(xù)表

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以R為溶磷量，A、B、C和D分別對(duì)應(yīng)蔗糖、草酸銨、無(wú)機(jī)鹽和磷酸三鈣的編碼。得到二次多項(xiàng)回歸方程：

對(duì)于上述回歸模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

由表3方差分析結(jié)果可知，模型的F=95.03，P＜0.000 1差異極顯著，并且失擬項(xiàng)P=0.672 5＞0.05，故說(shuō)明該模型是顯著的。模型的決定系數(shù)R2=0.989 6，說(shuō)明擬合程度很好，且調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.979 2，預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2pre=0.955 1，方差相差很小，說(shuō)明可信度高，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)溶磷量最優(yōu)提取工藝。蔗糖、草酸銨和磷酸三鈣對(duì)溶磷量影響均顯著（P＜0.05），無(wú)機(jī)鹽對(duì)溶磷量影響不顯著（P＞0.05）；因素對(duì)溶磷量影響程度為D＞B＞A＞C。對(duì)于交互作用來(lái)說(shuō)，蔗糖和草酸銨、蔗糖和磷酸三鈣、草酸銨和磷酸三鈣以及無(wú)機(jī)鹽和磷酸三鈣交互作用對(duì)溶磷量的影響顯著（P＜0.05），蔗糖和無(wú)機(jī)鹽以及草酸銨和無(wú)機(jī)鹽交互作用對(duì)溶磷量的影響不顯著（P＞0.05），對(duì)于模型的二次項(xiàng)來(lái)說(shuō)均極顯著。

2.3.3 響應(yīng)面結(jié)果及分析

響應(yīng)面優(yōu)化模型各因素（蔗糖、草酸銨、無(wú)機(jī)鹽和磷酸三鈣）兩兩交互作用對(duì)溶磷量影響的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖3。

圖3 各因素交互作用對(duì)菌株GDF1溶磷能力影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on phosphorus-solubilizing ability of strain GDF1

由圖3分析可知，蔗糖和草酸銨交互作用對(duì)溶磷量影響的等高線圖為橢圓形，說(shuō)明蔗糖和草酸銨交互作用對(duì)溶磷量影響的顯著。當(dāng)草酸銨不變時(shí)，隨著蔗糖的增加，溶磷量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；同樣，當(dāng)蔗糖不變時(shí)，隨著草酸銨增加，溶磷量也呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。蔗糖和無(wú)機(jī)鹽以及草酸銨和無(wú)機(jī)鹽交互作用對(duì)溶磷量的影響的等高線圖都接近圓形，說(shuō)明對(duì)結(jié)果的影響不顯著（P＞0.05）。蔗糖和磷酸三鈣間交互作用對(duì)溶磷量的影響的等高線圖為橢圓形，且由圖3可以看出，結(jié)果隨著因素的改變的變化明顯，說(shuō)明此因素交互作用對(duì)結(jié)果的影響顯著。草酸銨和磷酸三鈣以及無(wú)機(jī)鹽和磷酸三鈣交互作用對(duì)溶磷量的影響的等高線圖為較扁的橢圓形，說(shuō)明對(duì)溶磷量的影響較為顯著，隨著因素的增加，溶磷量先增加，達(dá)到最大值后出現(xiàn)下降。

響應(yīng)面圖均為開口向下的凸面，故響應(yīng)值R存在極大值，為進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)果，根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件得出在蔗糖、草酸銨、無(wú)機(jī)鹽和磷酸三鈣交互影響下，最優(yōu)提取工藝為：蔗糖為10.65 g/L，草酸銨為0.61 g/L，無(wú)機(jī)鹽為1.02 g/L，磷酸三鈣為10.70 g/L。在此條件下模型預(yù)測(cè)的溶磷量為291.35 mg/L。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了方便實(shí)際操作，修改溶磷條件為蔗糖10.7 g/L，草酸銨0.6 g/L，無(wú)機(jī)鹽1.0 g/L，磷酸三鈣10.7 g/L。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)試，經(jīng)過(guò)3輪重復(fù)驗(yàn)證，驗(yàn)證組中測(cè)得的溶解磷量實(shí)際值為292.59 mg/L，與預(yù)測(cè)值291.35 mg/L接近，該結(jié)果說(shuō)明此模型具有較好的可信度，可用于后續(xù)研究。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明不同種類的碳源和氮源會(huì)影響菌株GDF1的溶磷效果，通過(guò)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面試驗(yàn)先后對(duì)菌株GDF1 的溶磷條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，耐高溫菌株GDF1的最佳解磷條件為：蔗糖10.7 g/L，草酸銨0.6 g/L，無(wú)機(jī)鹽1.0 g/L，磷酸三鈣10.7 g/L。在此優(yōu)化條件下，實(shí)際驗(yàn)證溶磷量為292.59 mg/L。本試驗(yàn)中的菌株GDF1是耐高溫解磷真菌，經(jīng)優(yōu)化后，在耐高溫解磷微生物中解磷性能表現(xiàn)良好，可作為耐高溫微生物制劑的潛在原料，為推動(dòng)耐高溫解磷微生物的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。