宋照軍，王樹寧，黃瀅潔，陳笑言，趙功玲，梁新紅

（河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

無花果（Ficus caricaL.）鮮果中含有豐富的維生素、有機(jī)酸、礦物質(zhì)、人體內(nèi)必需的氨基酸和膳食纖維等[1-2]，是一種藥食兩用的水果，可以潤(rùn)腸通便，生津止渴，消炎解痛消腫，含糖量高達(dá)24%[3]。山楂（Crataegi fructus）又名山里紅，含有大量的胡蘿卜素和黃酮類化合物等，具有降血脂、降血壓、抗心律不齊等作用，同時(shí)還具有消食化滯，健胃開脾，活血化痰的功能[4]，但山楂酸度較高，有機(jī)酸含量可達(dá)4.1%～7.3%[5]。將無花果和山楂混合釀造果酒能更好地協(xié)調(diào)山楂的酸度高和無花果含糖量高的特點(diǎn)。

目前有分別用山楂、無花果、山楂與谷類釀酒[6-8]的相關(guān)報(bào)道，但鮮見無花果和山楂復(fù)合酒的研究。用無花果釀造的酒中酸度較低，為達(dá)到酒品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，需加酸進(jìn)行成分調(diào)整[9]；用山楂釀造的酒中酸含量較高，而進(jìn)行降酸處理的步驟繁瑣、操作困難，且成本增加[10]。將無花果和山楂進(jìn)行復(fù)配，以期彌補(bǔ)釀造果酒中山楂糖度不足、酸過多和無花果酸度不足、糖過多的現(xiàn)象，同時(shí)使釀造果酒兼具兩種原料共有的特性。

本研究以新鮮山楂和無花果作為原料，采用邊浸漬邊發(fā)酵工藝，研究不同酵母、加糖量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵工藝的影響，為無花果和山楂的充分利用及豐富果酒種類提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮山楂果（河南豫北紅山楂）、無花果（新疆早黃無花果）：市售；葡萄酒酵母CECA、BV818、NSD：安琪酵母有限公司。甲醇標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；AL204/01型電子天平：梅特勒托利多儀器有限公司；JJ-2型組織搗碎機(jī)：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；pHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；0～50°（20 ℃）酒精計(jì)：黃驊渤海比重計(jì)廠；Multifuge X1R冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Scientific公司；TU-1810PC紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LC-10AT液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無花果山楂復(fù)合果酒的加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

無花果漿的制備：選取果粒飽滿，成熟度高，無腐爛狀態(tài)的新鮮無花果，用流動(dòng)的水清洗，瀝干水分后去梗，將其切成5 mm厚的薄片。稱取50 g無花果薄片，按照料液比1∶9（g∶mL）加水混合，即為無花果漿。

無花果山楂混合果漿的制備：挑選新鮮，顏色鮮紅，無蟲口腐爛的新鮮山楂果，用流水清洗，瀝干水分，用刀去核、去梗、去蒂，然后迅速進(jìn)行切片，稱取切片后的山楂150 g，放入制備好的無花果漿中，將無花果山楂混合液置于80～85 ℃水浴中浸提90 min，待果液冷卻后獲得無花果山楂混合果汁，制取的混合漿汁液的糖度為24.7 g/L，酸度為6.2 g/L。

調(diào)糖：糖度是影響酵母發(fā)酵、酒精產(chǎn)生及果酒口感的重要影響因素。添加一定量的蔗糖入無花果山楂混合果漿汁中，糖含量控制在105～185 g/L范圍。

添加酵母：將活性干酵母加入28 ℃溫水中，水∶酵母=20∶1（g∶mL），然后密封進(jìn)行活化20 min?；罨蟮慕湍赴?.1%接種量加入混合果液中。

發(fā)酵：在發(fā)酵溫度22～38 ℃的條件下發(fā)酵2～10 d。

陳釀：取發(fā)酵上清液，在4 ℃條件下陳釀28 d，使酒味協(xié)調(diào)，風(fēng)味更加突出。

1.3.2 無花果山楂復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

酵母種類：按照1.3.1方法制備無花果山楂混合漿汁若干份，分別加入4種不同酵母，即CECA、BV818、CECA+NSD（1∶1）和BV818+NSD（1∶1）。在發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d、加糖量150 g/L、酵母添加量均為0.1%的條件下，分別考察酵母種類對(duì)復(fù)合果汁發(fā)酵的影響。

加糖量：按照1.3.1方法制備無花果山楂混合漿汁若干份，在CECA酵母加入量0.1%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d的條件下，考察蔗糖添加量（105 g/L、125 g/L、145 g/L、165 g/L、185 g/L）對(duì)復(fù)合果漿汁發(fā)酵的影響。

發(fā)酵時(shí)間：按照1.3.1方法制備無花果山楂混合漿汁若干份，在發(fā)酵溫度30 ℃，加糖量165 g/L，酵母CECA的添加量0.1%條件下，考察發(fā)酵時(shí)間（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d）對(duì)復(fù)合果汁發(fā)酵的影響。

發(fā)酵溫度：按照1.3.1方法制備無花果山楂混合漿汁若干份，在發(fā)酵時(shí)間6 d，加糖量165 g/L，酵母CECA的添加量0.1%條件下，考察發(fā)酵溫度（22 ℃、26 ℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃）對(duì)復(fù)合果漿汁發(fā)酵的影響。

1.3.3 無花果山楂復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面分析法用以考察加糖量（A），發(fā)酵時(shí)間（B），發(fā)酵溫度（C）對(duì)無花果山楂復(fù)合果酒發(fā)酵的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，無花果山楂復(fù)合果酒的發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 無花果山楂復(fù)合果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design for fermentation conditions optimization of fig and hawthorn compound wine

1.3.4 無花果山楂復(fù)合果酒的品質(zhì)分析

（1）感官評(píng)定：依據(jù)國(guó)標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》[11]制定出無花果山楂復(fù)合酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)20位品酒師的感官品嘗，從香氣、色澤、味道典型性四個(gè)方面對(duì)無花果山楂復(fù)合果酒進(jìn)行感官評(píng)分，滿分100分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 無花果山楂復(fù)合果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fig and hawthorn compound wine

（2）理化指標(biāo)：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]測(cè)定總糖、總酸、酒精度，雜醇油含量；依據(jù)GB 5009.34—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中二氧化硫的測(cè)定》、GB 5009.266—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測(cè)定》、NY/T1600—2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測(cè)定》中方法分別檢測(cè)二氧化硫、甲醇、單寧的含量[13-15]。

（3）微生物指標(biāo)：參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》中方法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌數(shù)[16]：參照GB 29921—2013《食品中致病菌限量》中方法測(cè)定致病菌[17]。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

使用SPSS Statistic 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；使用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法進(jìn)行顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母種類的篩選

NSD為產(chǎn)香酵母，發(fā)酵能力有限；CECA常用于紅色水果；BV818對(duì)不良環(huán)境抗性較好。不同酵母種類對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵的影響，結(jié)果見表3。

表3 酵母種類對(duì)無花果山楂復(fù)合果酒發(fā)酵的影響Table 3 Effect of yeast species on fig and hawthorn compound wine fermentation

由表3可知，酵母CECA、BV818、CECA+NSD（1∶1）和BV818+NSD（1∶1）發(fā)酵的果酒的酒精度為（6.90±0.40）%vol～（7.30±0.03）%vol，經(jīng)顯著性方差分析，其酒精度無顯著性差異（P＞0.05）。其中CECA+NSD（1∶1）發(fā)酵果酒感官評(píng)分最高，為（88.60±0.12）分，此時(shí)酒液果香濃郁，口感均衡。一般情況下，CECA更適合干紅葡萄酒和紅色水果，BV818雖然對(duì)不良環(huán)境抗性較好，但其口感較差。因此，確定無花果山楂復(fù)合果酒釀造的最佳酵母組合為CECA+NSD（1∶1）。

2.2 加糖量對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵的影響

考察加糖量對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵酒精度和感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著加糖量在105～185 g/L范圍內(nèi)的增加，果酒的酒精度逐漸增加，加糖量在165 g/L時(shí)達(dá)到（7.90±0.40）%vol，隨著糖量的繼續(xù)增加，酒精度升高不顯著（P＞0.05）。加糖量在105～165 g/L時(shí)，復(fù)合果酒感官評(píng)分逐漸升高，當(dāng)加糖量達(dá)到165 g/L時(shí)，復(fù)合果酒感官評(píng)分最高，為（90.60±0.60）分，隨著糖量增加至185 g/L時(shí)，復(fù)合果酒感官評(píng)分顯著下降至（86.70±1.70）分（P＜0.05）。這可能是因?yàn)楫?dāng)加糖量達(dá)到165 g/L時(shí)，酒液中殘?zhí)?、酸性物質(zhì)和單寧等含量適中，所以口感較佳，再繼續(xù)增加糖的量，酒的甜度太高，破壞了酒香味，感官評(píng)分降低。因此，復(fù)合果酒發(fā)酵最佳加糖量為165 g/L。

圖1 加糖量對(duì)無花果山楂復(fù)合果酒發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of sugar addition on fig and hawthorn compound wine fermentation

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵的影響

發(fā)酵時(shí)間過短，果酒會(huì)發(fā)酵不完全，從而達(dá)不到酒精度的要求；發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致酒的口感變差，甚至?xí)懈瘮∽儔牡暮蠊鸞18]。考察時(shí)間對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵酒精度和感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在2～10 d范圍內(nèi)的增加，復(fù)合果酒酒精度在第6天之前大幅度增加，第6天達(dá)到（7.80±0.20）%vol，隨后酒精度變化不明顯，保持在（7.90±0.00）%vol不變。感官評(píng)分在發(fā)酵時(shí)間為2～6 d范圍內(nèi)逐漸增加，第6天達(dá)到最高，為（90.10±0.64）分，第6天之后感官評(píng)分值逐漸降低。因此，復(fù)合果酒最佳發(fā)酵時(shí)間是6 d。

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度對(duì)果酒發(fā)酵有很大影響。KILLIAN E等[19]認(rèn)為，發(fā)酵溫度低可以改善產(chǎn)品質(zhì)量，但進(jìn)一步降溫就會(huì)破壞這種平衡。考察溫度對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵酒精度和感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)無花果山楂復(fù)合果酒發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on fig and hawthorn compound wine fermentation

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度在22～30 ℃范圍內(nèi)的增加，果酒的酒精度隨之增加，并在發(fā)酵溫度30 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為（7.80±0.15）%vol，當(dāng)發(fā)酵溫度高于30 ℃之后，其酒精度在逐漸減少，原因可能是酵母對(duì)高溫沒有耐受性，溫度過高會(huì)使酵母失活；感官評(píng)分值在26 ℃時(shí)達(dá)到最高，為（91.20±0.35）分，之后隨著發(fā)酵溫度的升高，其感官評(píng)分值逐漸降低。因此，復(fù)合果酒發(fā)酵的最佳溫度是26 ℃。

2.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以加糖量（A），發(fā)酵時(shí)間（B），發(fā)酵溫度（C）為考察因素，感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)方案進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 無花果山楂果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 4 Design and results of response surface experiments design for fermentation conditions optimization of fig and hawthorn compound wine

表5 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 5 Variance analysis and significance test of regression model

采用Design-Expert 8.0.5 軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到感官評(píng)分（Y）對(duì)加糖量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=93.78+2.34A+4.16B+3.68C+5.10AB-2.38AC+1.92BC-9.02A2-7.46B2-6.99C2。

由表5可知：該回歸方程模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)P值=0.083 3＞0.05，失擬性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著。決定系數(shù)R2=0.979 4，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.952 8，說明模型可解釋97.94%的可變性，回歸模型有高度相關(guān)性，可以應(yīng)用于無花果山楂復(fù)合果酒釀造工藝研究的理論預(yù)測(cè)。對(duì)模型回歸方程系數(shù)顯著性試驗(yàn)說明，一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)AC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），一次項(xiàng)B、C、交互項(xiàng)AB、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。各因子對(duì)感官評(píng)分的影響依次是B（發(fā)酵時(shí)間）＞C（發(fā)酵溫度）＞A（加糖量）。

2.6 響應(yīng)面結(jié)果分析

響應(yīng)值和各試驗(yàn)因子構(gòu)成間的立體曲面和等高線見圖4。由圖4a可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間一定時(shí)，感官評(píng)分隨加糖量增加，呈先增大后減少的趨勢(shì)。當(dāng)加糖量一定時(shí)，感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間增加，呈先增大后減小的趨勢(shì)。等高線緊密，說明感官評(píng)分在試驗(yàn)變化范圍內(nèi)存有極高值，交互影響作用顯著，和方差分析結(jié)果相同。

由圖4b可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間一定時(shí)，感官評(píng)分隨發(fā)酵溫度上升而呈先增大后減少的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí)，感官評(píng)分隨發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)而呈先增大后減小的趨勢(shì)。圖中等高線緊密，說明感官評(píng)分在試驗(yàn)變化范圍內(nèi)有極高值，交互影響作用顯著，和方差分析的結(jié)果相同。

圖4 加糖量、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度交互作用對(duì)無花果山楂復(fù)合果酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between sugar addition,fermentation temperature and time on sensory score of fig and hawthorn compound wine

由圖4c可知，當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí)，隨著加糖量增加感官評(píng)分呈先增大后減少的趨勢(shì)。當(dāng)加糖量一定時(shí)，感官評(píng)分在發(fā)酵溫度增加時(shí)，呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。圖中等高線緊密，說明感官評(píng)分在試驗(yàn)變化范圍內(nèi)存有極高值，與方差分析結(jié)果相同。

2.7 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

通過回歸模型的預(yù)測(cè)得到無花果山楂復(fù)合果酒的最佳發(fā)酵工藝為加糖量為169.03 g/L，發(fā)酵時(shí)間為6.77 d，發(fā)酵溫度為27.13 ℃。此時(shí)感官評(píng)分的理論值為95.33分。為了便于實(shí)際操作，將發(fā)酵工藝參數(shù)修正為加糖量169 g/L，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵溫度27 ℃。在此優(yōu)化條件下，感官評(píng)分實(shí)際值為95.30分，與理論預(yù)測(cè)值誤差較小，證明該模型可有效預(yù)測(cè)無花果山楂復(fù)合果酒工藝研究。

2.8 無花果山楂復(fù)合果酒的質(zhì)量分析

無花果山楂復(fù)合果酒酒香純正，清澈透亮，呈淺紅色。酒精度為7.8%vol，總糖為1.15 g/L，總酸為6.85 g/L，單寧含量為39.05 mg/L，甲醇含量為0.002 g/100 mL，雜醇油含量為0.001 g/100 mL；細(xì)菌總數(shù)為15 CFU/mL，大腸桿菌數(shù)為1 MPN/100 mL，未檢測(cè)出致病菌。其品質(zhì)指標(biāo)均符合相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[20]。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面工藝優(yōu)化，預(yù)測(cè)得到無花果山楂復(fù)合果酒工藝最佳工藝參數(shù)為：選用酵母為CECA+NSD（1∶1），加糖量169 g/L，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵溫度27 ℃。此優(yōu)化條件下得到復(fù)合果酒酒精度為7.8%vol，感官評(píng)分為95.30分，釀造的復(fù)合果酒口感酸甜協(xié)調(diào)，果香濃郁。各項(xiàng)理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)均符合相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。