邱勇　周軍格　陳俊瑜

【摘要】目的 探討人巨細(xì)胞病毒IE1蛋白（HCMV-IE1）及WD重復(fù)蛋白5（WDR5）在高級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義。方法 采用免疫組織化學(xué)（免疫組化）方法檢測HCMV-IE1和WDR5在60份高級別膠質(zhì)瘤組織及20份正常腦組織中的表達(dá)，分析HCMV感染與WDR5的相關(guān)性及兩者對膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響。結(jié)果 53 份（88.3%）高級別膠質(zhì)瘤組織中的HCMV-IE1呈陽性表達(dá)，20份正常腦組織中均無HCMV-IE1表達(dá)（P < 0.001）;HCMV-IE1表達(dá)程度低者總生存率優(yōu)于表達(dá)程度高者（P = 0.037）。49份（81.6%）高級別膠質(zhì)瘤組織中WDR5表達(dá)陽性，11份（5.5%）正常腦組織中WDR5表達(dá)陽性（P = 0.009）。在60份高級別膠質(zhì)瘤組織中，HCMV-IE1與WDR5同時(shí)高表達(dá)有27例（45.0%），同時(shí)低表達(dá)有14例（23.3%），HCMV-IE1表達(dá)與WDR5表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.336，P = 0.009）。結(jié)論 HCMV-IE1與高級別膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，是判斷高級別膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)，其機(jī)制可能與HCMV-IE1和WDR5呈正相關(guān)有關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】人巨細(xì)胞病毒;高級別膠質(zhì)瘤;WD重復(fù)蛋白5

【Abstract】Objective To investigate the expression and significance of human cytomegalovirus （HCMV）-IE1 protein and WDR5 protein in high grade glioma （HGG）.? Methods The expression of HCMV IE1 and WD repeat-containing protein （WDR5） proteins was detected by immunohistochemistry in 60 HGG tissues and 20 normal brain tissues. The correlation between HCMV infection and WDR5 protein and their influence on glioma prognoses were analyzed.? Results HCMV-IE1 protein was positively expressed in 53 HGG tissues （88.3%） while not expressed in 20 normal brain tissues （P < 0.001）. The overall survival rate of HGG patients with low expression level of HCMV-IE1 was better than those with high expression level of HCMV-IE1 （P = 0.037）. WDR5 protein expression was positive in 49 （81.6%） HGG tissues and in 11 （5.5%） normal brain tissues （P = 0.009）. Among 60 HGG tissues， 27 cases （45.0%） had simultaneously high expression HCMV-IE1 protein and WDR5 protein， and 14 cases （23.3%） had simultaneously low expression. The expression of HCMV-IE1 protein was positively correlated with that of WDR5 protein （r = 0.336， P = 0.009）. Conclusions HCMV-IE1 protein is associated with the initiation and development of HGG and is an indicator of the prognosis of HGG.The mechanism may be associated with the positive correlation between HCMV-IE1 and WDR5.

【Key words】Human cytomegalovirus;High grade glioma;WD repeat-containing protein

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性神經(jīng)上皮細(xì)胞惡性腫瘤，WHO依據(jù)腫瘤的惡性程度將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ ～ Ⅳ級，其中低級別膠質(zhì)瘤（LGG）包含Ⅰ、Ⅱ級，高級別膠質(zhì)瘤（HGG）包含Ⅲ、Ⅳ級[1]。近年來隨著神經(jīng)外科顯微手術(shù)技術(shù)及手術(shù)器械的發(fā)展，膠質(zhì)瘤的手術(shù)治療效果取得改善，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后未能獲得根本的改善，尤其是HGG，腫瘤細(xì)胞呈侵襲性生長，術(shù)后腫瘤短期內(nèi)就復(fù)發(fā)。手術(shù)輔以同步放射治療或化學(xué)治療的標(biāo)準(zhǔn)化方案是目前腦膠質(zhì)瘤的主要治療手段，由于HGG本身發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，其容易對放射治療及化學(xué)治療發(fā)生抵抗，雖然各種新治療方法不斷涌現(xiàn)，但治療效果仍較差[2]。目前腫瘤的靶向及免疫治療等個(gè)體化精準(zhǔn)治療成為新的熱點(diǎn)，而我們對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病因?qū)W及遺傳表征知之甚少。目前認(rèn)為膠質(zhì)瘤是一種“冷腫瘤”，腫瘤突變負(fù)荷較低，對傳統(tǒng)放射治療、化學(xué)治療以及免疫治療等方法響應(yīng)有限，因而迫切需要研究膠質(zhì)瘤可利用的新的靶點(diǎn)和遺傳學(xué)表征，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。

最近的研究表明，病毒感染可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3]。人巨細(xì)胞病毒（HCMV）屬于皰疹病毒家族，人巨細(xì)胞病毒基因組編碼有200多種蛋白質(zhì)，包括HCMV IE1蛋白（HCMV-IE1）和PP65抗原等。它們的表達(dá)發(fā)生在感染后的一系列階段。有研究表明HCMV感染及病毒蛋白與多種惡性腫瘤相關(guān)[4]。同時(shí)已陸續(xù)有研究報(bào)道膠質(zhì)瘤中存在HCMV抗原的表達(dá)甚至完整病毒，而其鄰近正常腦組織中則檢測不到，特別是在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中，膠質(zhì)瘤中存在蛋白的陽性率高達(dá)93% ～ 100%，甚至有報(bào)道稱術(shù)后抗病毒治療能明顯延長患者生存期，但其具體機(jī)制尚未清楚。在我國，健康人群中HCMV的感染率（90%左右）高于歐美國家（60% ～ 70%）。WD重復(fù)蛋白5（WDR5）是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中的核心組分之一，參與介導(dǎo)H3K4基因轉(zhuǎn)錄激活過程，研究顯示W(wǎng)DR5在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。

本研究采用免疫組織化學(xué)（免疫組化）方法檢測了HCMV-IE1及WDR5在HGG組織中的表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析了兩種蛋白的相關(guān)性及其對膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響。

材料與方法

一、組織標(biāo)本

60份HGG組織均為武漢腦科醫(yī)院2013年至2018年神經(jīng)外科手術(shù)切除的原發(fā)腫瘤標(biāo)本，20份正常腦組織為該院同時(shí)期的腦外傷內(nèi)減壓手術(shù)患者標(biāo)本。60份HGG組織來自男性患者33例、女性患者27例，年齡（48.2±16.2）歲;標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋。按照2016年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類和分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診，其中WHO Ⅲ級44例，包括間變型星形細(xì)胞瘤35例、間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤9例;WHO Ⅳ級16例，均為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。所有患者術(shù)后均持續(xù)隨訪，最長隨訪時(shí)間5年。本研究經(jīng)武漢腦科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、免疫組化方法

采用聚合物-過氧化物酶免疫組化兩步法。組織蠟塊連續(xù)切片，厚5 μm，65℃烤片2 h后備用。二甲苯常規(guī)脫蠟，浸入乙二胺四乙酸緩沖液中高熱修復(fù)。切片用3% 過氧化氫于室溫下孵育15 min，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。非免疫正常山羊血清100 μl封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育60 min。滴加一抗HCMV-IE1（英國Abcam公司）稀釋度1∶100及WDR5（上海生工生物公司）稀釋度1∶100。于4℃冰箱孵育過夜，再用Biotin標(biāo)記的山羊抗鼠二抗工作液室溫孵育30 min。用辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素，室溫孵育30 min。用二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。以HCMV-IE1、WDR5表達(dá)陽性的結(jié)腸癌組織切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

三、建立免疫組化分級和強(qiáng)度量表，

免疫染色切片由2名獨(dú)立的組織病理學(xué)專家進(jìn)行評估，所有的免疫組化染色均給予一個(gè)等級（基于陽性百分比）。在高倍鏡下從每例標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)較強(qiáng)的區(qū)域隨機(jī)選取5個(gè)視野，共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞的估計(jì)百分比確定4個(gè)等級：（-）<5%;（+）≥5% ～ 30%;（++）≥30% ～ 50%;（+++）≥50%。依據(jù)陽性表達(dá)的等級，我們將腦腫瘤標(biāo)本分為2組，低表達(dá)組（-或+）和高表達(dá)組（++或+++）。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， HCMV-IE1及WDR5表達(dá)水平在HGG與正常腦組織之間的差異采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。進(jìn)行HCMV-IE1蛋白與WDR5表達(dá)相關(guān)性關(guān)聯(lián)分析。采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行生存分析，生存曲線的繪制采用Kaplan-Meier法，生存曲線比較采用log-rank檢驗(yàn)。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、HCMV-IE1、WDR5在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

在60份HGG組織中有53份HCMV-IE1呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率88.3%。其中16份（+）、18份（++）、19份（+++），HCMV-IE1位于腫瘤細(xì)胞的胞核和胞漿。在60份膠質(zhì)瘤組織中，高表達(dá)組有37份（61.7%）、低表達(dá)組有23份（38.3%）。HCMV-IE1在20份正常腦組織中均無表達(dá)。HGG組織中HCMV-IE1表達(dá)水平高于正常腦組織（Z = -6.110，P < 0.001），見圖1。

在60份HGG組織中有49份WDR5呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為81.6%。其中13份（+）、19份（++）、17份（+++）。WDR5位于腫瘤細(xì)胞的胞核。在60份膠質(zhì)瘤組織中，高表達(dá)組有36份（60.0%）、低表達(dá)組有24份（40.0%）。在20份腦組織中11份WDR5呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率55%，其中高表達(dá)組6份（30.0%）、低表達(dá)組14份（70.0%），HGG組織中WDR5表達(dá)水平高于正常腦組織（Z = -2.569，P = 0.009），見圖1。

二、HCMV-IE1與WDR5的相關(guān)性

在60份HGG中，HCMV-IE1與WDR5同時(shí)高表達(dá)有27份（45.0%），同時(shí)低表達(dá)有14份（23.3%），HCMV-IE1表達(dá)與WDR5表達(dá)相關(guān)（r = 0.318，P = 0.009）。

三、HCMV-IE1表達(dá)與HGG預(yù)后的關(guān)系

HCMV-IE1低表達(dá)組23例的中位生存期為33個(gè)月，高表達(dá)組37例的中位生存期為18個(gè)月，低表達(dá)組患者總生存率優(yōu)于高表達(dá)組（P = 0.037），見圖2。

討論

HCMV是人類皰疹病毒，其基因組大小約235 kb。病毒基因表達(dá)呈時(shí)序性，分為立即早期、早期和晚期。對于免疫力正常的健康人群，HCMV感染常無明顯臨床癥狀，但在有免疫缺陷或免疫力低下的人群，HCMV感染常導(dǎo)致嚴(yán)重臨床后果，表現(xiàn)為病毒性肺炎、先天性腦畸形、腦炎等。依據(jù)不同國家和人種，HCMV在健康人群中的感染率可達(dá)70 % ～ 100 %，本課題組調(diào)查了本地區(qū)的303名健康人HCMV的感染情況，結(jié)果顯示感染陽性率為93.7%，進(jìn)一步證實(shí)HCMV感染在我國健康人群中高發(fā)[6]。

目前的研究顯示，病毒感染可以通過干預(yù)腫瘤微環(huán)境來影響腫瘤的進(jìn)展，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。現(xiàn)在研究表明HCMV與多種惡性腫瘤相關(guān)，如消化系統(tǒng)腫瘤、肺惡性腫瘤及乳腺癌等。HCMV-IE1通過激活環(huán)氧酶-2（Cox-2）誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的合成，激活血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤發(fā)生發(fā)展[7]。但HCMV與膠質(zhì)瘤的具體關(guān)系及機(jī)制不明，存在巨大爭議。有學(xué)者認(rèn)為HCMV與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)，是一個(gè)起始因素，但與膠質(zhì)瘤的病理級別及預(yù)后無關(guān)[8-9]。而其他學(xué)者的觀點(diǎn)與之截然相反，認(rèn)為HCMV-IE1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于對照腦組織，其表達(dá)程度與膠質(zhì)瘤病理級別有相關(guān)性[10]。同時(shí)HCMV與膠質(zhì)瘤的預(yù)后明顯相關(guān)[11]。但有學(xué)者提出異議，認(rèn)為上述實(shí)驗(yàn)研究未能將患者腫瘤病理級別對膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響因素進(jìn)行剔除。本課題組發(fā)現(xiàn)HCMV感染與HGG預(yù)后的國內(nèi)相關(guān)研究甚少，故進(jìn)行了本項(xiàng)研究。

WDR5是WD-40蛋白家族的成員之一，具有高度的保守性。WDR5作為MLL復(fù)合體的重要成員，能引起組蛋白H3K4的甲基化，從而參與多項(xiàng)細(xì)胞的生命活動，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞自我編程以及更新，誘導(dǎo)細(xì)胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA處理、基因調(diào)控、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)[12]。最近的研究表明，WDR5在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，Xu等[13]在甲狀腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)WDR5的過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并且與患者生存率密切相關(guān)。Chen等[14]的研究表明，WDR5蛋白在膀胱癌中也呈高表達(dá)狀態(tài)，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及對化學(xué)治療的耐藥性，進(jìn)一步研究表明WDR5是通過對細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)進(jìn)而激活其轉(zhuǎn)錄從而實(shí)現(xiàn)其功能的。WDR5在膠質(zhì)瘤組織中的作用尚無報(bào)道。

本課題組收集60份HGG標(biāo)本并對患者持續(xù)隨訪，結(jié)果顯示HCMV感染僅在膠質(zhì)瘤中存在，不存在于正常腦組織中，提示HCMV感染與HG的發(fā)生發(fā)展存在一定聯(lián)系。同時(shí)HCMV-IE1低表達(dá)組患者總生存率高于高表達(dá)組患者，本組患者均為HGG患者，剔除了病理級別因素對膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響，這項(xiàng)結(jié)果提示HCMV-IE1與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展相關(guān)，可以作為判斷HGG預(yù)后的指標(biāo)。本研究還顯示，HGG組織中WDR5表達(dá)高于正常腦組織，我們認(rèn)為WDR5與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)。目前有研究表明HCMV感染時(shí)，其通過HCMV-IE1上調(diào)WDR5的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖分化，同時(shí)WDR5促進(jìn)病毒的復(fù)制[15]。本研究顯示HCMV-IE1表達(dá)與WDR5表達(dá)呈正相關(guān)，結(jié)合前述研究，我們認(rèn)為HCMV可能通過調(diào)節(jié)WDR5，最終激活膠質(zhì)瘤相關(guān)靶基因MMP-9、c-myc、 Cox-2等的轉(zhuǎn)錄， 從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，同時(shí)影響膠質(zhì)瘤對化學(xué)治療藥物的敏感性[5， 14， 16]。

膠質(zhì)瘤患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范治療后預(yù)后仍極差，特別是HGG。因而針對HGG的靶向治療和免疫治療等個(gè)體化精準(zhǔn)治療已成為研究的熱點(diǎn)。但即使應(yīng)用新的靶向治療及腫瘤電場治療等方法，治療效果仍然差強(qiáng)人意，患者預(yù)后極差。所以利用HCMV抗原作為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)可為HGG患者帶來新的希望。臨床實(shí)驗(yàn)研究顯示，常規(guī)綜合治療輔助抗病毒藥物可能是一種新的治療膠質(zhì)瘤方案[17]。HCMV抗原也可以作為免疫治療的有效靶點(diǎn)[18]。多項(xiàng)針對HCMV抗原設(shè)計(jì)的免疫治療臨床試驗(yàn)例如自體巨細(xì)胞病毒特異性T淋巴細(xì)胞，靶向HCMV的CARs和多肽類疫苗等，均明顯改善患者的無進(jìn)展生存期及總生存期[19]。另外，針對WDR5的藥物可通過阻斷MLL-WDR5蛋白復(fù)合體的形成，干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤的生長[20]。

綜上所述，HCMV感染及其蛋白HCMV-IE1通過調(diào)節(jié)WDR5的表達(dá)，影響膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展，這不是一種伴隨的偶然現(xiàn)象，HCMV-IE1可以作為判斷HGG預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)也為HGG患者的治療提供新的靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-03-26）

（本文編輯：洪悅民）