吳雙華　謝璨燦　李崢嶸　曾維忠　王婷

【摘要】目的 探討Yes 相關(guān)蛋白（YAP）在膿毒癥患者外周血單個核細胞（PBMC）中的表達情況及臨床意義。方法 檢測65例膿毒癥患者（膿毒癥組）和36名健康志愿者（對照組）PBMC中YAP mRNA的表達水平。根據(jù)28 d臨床結(jié)局將膿毒癥組分為死亡亞組（26例）和存活亞組（39例），比較2個亞組的急性生理學(xué)及慢性健康狀況評分系統(tǒng)（APACHE Ⅱ）評分和PBMC中YAP mRNA的表達水平，采用Pearson相關(guān)分析兩類指標的相關(guān)性，并用受試者工作特征（ROC）曲線分析YAP mRNA表達水平預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后的效果。結(jié)果 膿毒癥組和對照組一般情況具可比性（P > 0.05）。膿毒癥組PBMC中YAP mRNA表達水平高于對照組（P < 0.05）。死亡亞組患者入院時的APACHE Ⅱ評分及PBMC中YAP mRNA表達水平均高于存活亞組（P < 0.05）。膿毒癥患者PBMC中YAP mRNA表達水平與APACHEⅡ評分呈正相關(guān)（r = 0.660，P < 0.05），YAP mRNA表達水平預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后的ROC曲線的曲線下面積為0.691，靈敏度和特異度均為0.692。結(jié)論 膿毒癥患者PBMC中的YAP表達水平高于健康者且與病情嚴重程度呈正相關(guān)，有助于判斷患者的病情嚴重程度與預(yù)測預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】Yes相關(guān)蛋白;膿毒癥;外周血單個核細胞

【Abstract】Objective To investigate the expression and clinical significance of Yes-associated protein （YAP） in peripheral blood mononuclear cells （PBMC） of sepsis patients. Methods The expression levels of YAP mRNA in PBMC were detected in 65 sepsis patients （sepsis group） and 36 healthy volunteers （control group）. According to the clinical outcome at day 28， the sepsis group was divided into death subgroup （26 cases） and survival subgroup （39 cases）. The acute physiology and chronic health status scoring system （APACHE Ⅱ） score and YAP mRNA expression level in PBMC were compared in two groups. Pearson correlation was used to analyze the correlation between two types of indices. Receiver-operating characteristic curve （ROC） was used to analyze the effect of YAP mRNA expression levels in predicting prognoses of sepsis patients. Results The general conditions of sepsis group and control group were comparable （P > 0.05）. The expression level of YAP mRNA in PBMC in sepsis group was higher than that in control group （P < 0.05）. Patients in death subgroups had higher APACHEⅡ scores and YAP mRNA expression levels in PBMC on admission to hospital than those in survival subgroup （P < 0.05）. The expression level of YAP mRNA in sepsis patients was positively correlated with the APACHE Ⅱ score （r = 0.660， P < 0.05）. The area under the curve of ROC that predicts prognoses of sepsis patients based on YAP mRNA expression levels was 0.691. Both the sensitivity and the specificity were 0.692.? Conclusion The YAP expression levels in PBMC were higher in sepsis patients than in healthy subjects and possitively correlated with the severity of sepsis， which was helpful to judge the severity of sepsis and predict the prognoses of patients.

【Key words】Yes-associated protein;Sepsis;Peripheral blood mononuclear cells

膿毒癥是目前臨床上急危重癥患者死亡的主要原因之一[1]。Yes相關(guān)蛋白（YAP）作為一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子，能與多種蛋白質(zhì)相互作用并激活對細胞存活、趨化、分化和增殖起重要作用的靶基因的表達，是哺乳動物的細胞中 Hippo 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子[2]。近年來的研究顯示有部分革蘭陽性菌通過 Toll 依賴性途徑激活果蠅中的Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提示YAP在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮一定的調(diào)控效應(yīng)[3-4]。在本研究中，筆者通過觀察膿毒癥患者外周血單個核細胞（PBMC）中YAP的表達水平及其與患者急性生理學(xué)及慢性健康狀況評分系統(tǒng)（APACHE Ⅱ）評分的相關(guān)性，探討YAP是否參與膿毒癥的發(fā)生過程及其能否作為判斷患者病情嚴重程度與預(yù)后的指標。

對象與方法

一、研究對象

將2018年1月至2019年12月我院收治的65例膿毒癥患者設(shè)為膿毒癥組，其中男51例、女14例，年齡（51.5±16.9）歲，其中腹腔感染25例、泌尿系統(tǒng)感染21例、肺部感染15例、皮膚軟組織感染4例。根據(jù)28 d臨床治療結(jié)局又將65例患者分為死亡亞組和存活亞組，其中死亡26例、存活39例。全部病例符合2016年國際膿毒癥與感染性休克治療指南制訂的診斷標準[5]。全部病例均排除以下情況：住院時間小于72 h;年齡< 18歲或> 80歲;孕期或哺乳期婦女;合并有惡性腫瘤、原有免疫功能缺陷性疾病、慢性腎臟疾病、終末期肝衰竭、心肺復(fù)蘇后、持續(xù)感染性疾病如HIV感染、結(jié)核感染及長期使用免疫抑制藥物和細胞毒性藥物;放棄治療及其他原因?qū)е虏v資料收集不完整。將同時期的36名健康志愿者設(shè)為對照組，其中男28名、女8名，年齡（46.1±13.3）歲。本研究通過了我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準，并取得了所有參與研究的患者或家屬及志愿者的知情同意。

二、方 法

1.主要試劑與儀器

TRIzolTM LS Reagent（美國Thermo Fisher Scientific）、YAP引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]、人外周血單個核細胞分離液試劑盒P8680（北京Solarbio科技有限公司）、2，3二羥基丙醛3磷酸脫氫酶（GAPDH）[生工生物工程（上海）股份有限公司]、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）;PCR擴增儀SLAN-96S（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。

2.操作步驟

采集膿毒癥患者（入院時）及健康志愿者外周靜脈血10 ml，加入乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）抗凝管，按照人外周血單個核細胞分離液說明書分離單個核細胞，加入RNA穩(wěn)定劑中保存，再置于-70℃冰箱保存待檢。按照TRIzolTM LS Reagent的使用說明書提取單個核細胞總RNA，提取的總RNA用紫外分光光度計測量波長260 nm和280 nm的光密度（A）值，并計算A260/A280以估測RNA的純度，若A260/A280值≥1.8，表明RNA樣品沒有蛋白質(zhì)的殘留，可以備用，獲取RNA濃度值。稀釋后的總RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，具體反應(yīng)體系如下：5×PrimeScript Buffer 4 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl，Oligo dT Primer 1 μl，Random 6 mers 1 μl，稀釋后的RNA 13 μl（總共20 μl體系）;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃15 s。依據(jù) Gen Bank數(shù)據(jù)庫提供的 GAPDH及YAP序列，采用Pmerremier 5.0軟件設(shè)計人源引物，引物序列如下：GAPDH：上游5-GATTTGGTCGTATTGGGCGC-3，下游5-T?TCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3;YAP引物：上游5-TTGGCTAGACCCAAGGCTTG-3，下游5-GTTGCTGCTGGTTGGAGTTG-3。將逆轉(zhuǎn)錄得到的反向轉(zhuǎn)錄DNA（cDNA）稀釋之后，用PCR擴增儀SLAN-96S測定其擴增表達。其反應(yīng)體系總共20μl（cDNA 2 μl、滅菌水 6 μl、基因前引物0.8 μl、基因后引物0.8 μl、TB Green Premix Ex Tap Ⅱ 10 μl、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl）。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參。最后結(jié)果采用2-△△Ct（△Ct = Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，-△△Ct=△Ct對照組基因-△Ct膿毒癥組基因）計算基因相對表達量。

3.觀察指標

計算患者的APACHE Ⅱ評分。檢測膿毒癥組和對照組PBMC YAP mRNA表達情況。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布計量資料采用表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，并用受試者工作特征（ROC）曲線分析YAP mRNA表達水平預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后的效果。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、膿毒癥組和對照組一般情況和PBMC YAP mRNA表達情況比較

膿毒癥組和對照組的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05）。2組的外周血單個核細胞YAP mRNA相對表達量分別為1.45±0.27和1.11±0.28，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），見表1。

二、膿毒癥患者APACHE Ⅱ評分、YAP mRNA表達及兩者的相關(guān)性

死亡亞組和存活亞組患者入院時的APACHE Ⅱ評分分別為（21.89±5.63）分與（15.64±5.21）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 4.581，P < 0.001）;2亞組患者外周血單個核細胞YAP mRNA相對表達量分別為1.54±0.28、1.38±0.24，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 2.468，P = 0.016）。膿毒癥患者外周血單個核細胞YAP mRNA表達水平與APACHEⅡ評分呈正相關(guān)（r = 0.660，P < 0.05）

三、YAP mRNA表達水平預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后的ROC

YAP mRNA預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后的ROC曲線的曲線下面積為0.691 （95%CI為 0.549 ～ 0.832，P < 0.01），Cut-off值為1.485，靈敏度和特異度均為0.692，見圖1。

討論

膿毒癥已成為當前急危重癥醫(yī)學(xué)臨床救治過程中面臨的最主要的和最棘手的情況之一，是感染致死的主要原因。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展進步，新的診療方案、手段和藥物不斷被提出，但是在臨床治療中膿毒癥的發(fā)病率仍在上升，病死率高達20% ～ 30%[6]。而經(jīng)過積極救治幸存下來的患者中又有300余萬例存在著不同程度的認知功能障礙致其生活不能完全自理[6]。因此盡早識別、積極診治和早期評估療效及預(yù)后并提高膿毒癥救治的成功率和有效率是醫(yī)務(wù)人員和患者及家屬共同關(guān)注的問題[6-7]。

Hippo信號通路主要由一系列相對高度保守的激酶所構(gòu)成，是一條主要抑制細胞生長分化的信號通路，其主要作用在于調(diào)控機體干細胞的自我分化更新的能力和調(diào)節(jié)機體臟器的形態(tài)大小的變化[8]。YAP是近年來研究者新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，是Hippo信號通路的主要下游效應(yīng)物。該蛋白主要與非受體酪氨酸激酶 YES 的 SH3片段緊密結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其富含脯氨酸成分，估計分子量約為65 kD，人類YAP主要位于染色體11q22區(qū)[9]。作為調(diào)控 Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白，YAP在調(diào)控細胞的增殖、分化、遷徙、趨化和凋亡、壞死等過程中均起著至關(guān)重要的作用[10]。以往YAP研究的熱點多聚焦于腫瘤相關(guān)領(lǐng)域，研究顯示YAP在肝癌、肺癌、腎癌及婦科腫瘤等的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著極其重要的角色[11]。近年來越來越多的研究顯示YAP在調(diào)控炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中也起相當重要的作用。

本課題組主要通過研究膿毒癥患者外周血單個核細胞的YAP基因表達以了解其變化及臨床意義。本研究中的膿毒癥患者以男性為主，年齡以中老年為多，這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果類似[3]。而本研究中的患者主要在綜合ICU中接受治療，其病種較廣泛，以腹腔感染、泌尿系統(tǒng)感染和肺部感染最常見，這與大多數(shù)綜合ICU收治病種相似[5]。

本研究中膿毒癥組患者外周血單個核細胞YAP mRNA相對表達量高于對照組。胡迎春等[12]通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)構(gòu)建大鼠膿毒癥模型，建模 48 h后，與正常組和假手術(shù)組相比，膿毒癥組大鼠肝臟組織中 YAP1 基因及蛋白表達水平增加（P < 0.05）。初步驗證了Hippo信號通路中的YAP 因子可能參與了膿毒癥肝臟病變的發(fā)生發(fā)展過程。左文等[13]通過內(nèi)毒素刺激小鼠巨噬細胞構(gòu)建膿毒癥細胞模型，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞向M1型巨噬細胞分化，并通過蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)去磷酸化的YAP表達水平升高，磷酸化的YAP表達水平降低，所以他們推測去磷酸化的YAP可能與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

YAP在膿毒癥中升高的原因和具體機制尚未完全明確。有研究表明YAP是血管內(nèi)皮細胞活化和炎癥的基本調(diào)節(jié)劑，炎癥介質(zhì)可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞YAP的高表達[3-4]。YAP與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF 6）相互作用，通過K48泛素化促進TRAF 6的降解，抑制K63連接的泛素化，從而阻止核轉(zhuǎn)錄因子（NF） -κB的激活。Yi等[14]發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素通過激活巖石使YAP進入ECs核團并與

Egr-1結(jié)合。Song等[15]證明內(nèi)毒素可激活巨噬細胞/

肝臟庫普弗細胞中的YAP與炎癥細胞因子啟動子區(qū)的Tead結(jié)合，從而進一步誘導(dǎo)促炎細胞因子的表達，引起多個器官功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致感染加重和膿毒性休克的發(fā)生。

通過追蹤觀察膿毒癥患者28 d的臨床結(jié)局，我們發(fā)現(xiàn)死亡亞組與存活亞組外周血單個核細胞YAP mRNA和APACHE Ⅱ評分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進一步的Pearson相關(guān)分析顯示兩者呈正相關(guān)。APACHE Ⅱ是目前國際上公認最權(quán)威、最實用、臨床應(yīng)用最為廣泛的急危重癥患者病情評估評分系統(tǒng)，隨著分值的升高，患者的病情越危重，死亡的風險越高，APACHE Ⅱ評分能夠較為全面地反映患者機體狀況和評估危重癥患者的預(yù)后[16]。本研究結(jié)果提示YAP的表達可能與患者預(yù)后有關(guān)，高YAP表達預(yù)示不良預(yù)后，患者的死亡可能性更大。ROC曲線分析結(jié)果也顯示YAP在膿毒癥患者預(yù)后方面具有較好的預(yù)測效能。

綜上所述，膿毒癥患者外周血單個核細胞YAP mRNA表達水平升高，YAP與膿毒癥患者病情的嚴重程度及預(yù)后存在著一定的相關(guān)性，YAP有助于臨床上早期評估膿毒癥患者的預(yù)后，從而為治療提供參考，具有較好的臨床意義和推廣價值。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-03-31）

（本文編輯：洪悅民）