付寶軍　姜靜靜　黃玉瓊　林宗航　李恒

【摘要】目的 探討脊髓集落刺激因子1（CSF-1）誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞活化在長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛大鼠中的作用。方法 采用隨機(jī)數(shù)表法將30只健康雄性SD大鼠分為3組（每組10只）：對(duì)照組（Control組）、化學(xué)治療痛組（CINP組）、化學(xué)治療痛+ CSF-1中和抗體組（CINP+anti組）?；瘜W(xué)治療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型采用隔日腹腔注射長(zhǎng)春新堿125 μg/kg（共計(jì)4次）的方法建立，CINP+anti組在CINP組的給藥基礎(chǔ)上加予CSF-1中和抗體。于首次注射長(zhǎng)春新堿前及注射后1、3、5、7 d采用機(jī)械縮足反射閾值（MWT）和熱縮足反射潛伏期（TWL）評(píng)價(jià)大鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏;采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)脊髓CSF-1以及脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物離子化鈣結(jié)合適配分子1（Iba1）的表達(dá)情況;采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)脊髓CSF-1 mRNA和Iba1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 與Control組比較，CINP組大鼠在首次注射長(zhǎng)春新堿后3、5、7 d的MWT和TWL更低（P均< 0.01）;與CINP組比較，CINP+anti組首次注射長(zhǎng)春新堿后5、7 d的MWT和TWL更高（P均< 0.01）。與Control組比較，CINP組脊髓CSF-1、Iba1表達(dá)上調(diào)（P均< 0.01）;與CINP組比較，CINP+anti組CSF-1、Iba1表達(dá)下調(diào)（P均< 0.05）。與Control組比較，CINP組脊髓Iba1 mRNA表達(dá)上調(diào)（P < 0.01）;與CINP組比較，CINP+anti組脊髓Iba1 mRNA表達(dá)下調(diào)（P < 0.01）。結(jié)論 長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛，其機(jī)制可能與大鼠脊髓CSF-1活化脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】長(zhǎng)春新堿;神經(jīng)病理性疼痛;小膠質(zhì)細(xì)胞; 集落刺激因子1

【Abstract】Objective To investigate the role of spinal colony-stimulating factor 1 （CSF-1）-induced microglia activation in rat models with neuropathic pain induced by vincristine. Methods Thirty healthy male SD rats were divided into 3 groups by random number table method （10 rats in each group）： control group （control group）， chemotherapy-induced neuropathic pain group （CINP group） and chemotherapy-induced neuropathic pain+CSF-1 neutralizing antibody group （CINP+anti group）. The CINP rat models were established by intraperitoneal administration of vincristine 125μg/kg on alternate days for 4 times. In the CINP+anti group， CSF-1 neutralizing antibody was supplemented. Mechanical allodynia and heat hyperalgesia were evaluated by mechanical withdrawal threshold （MWT） and thermal withdrawal latency （TWL） before and 1-， 3-， 5- and 7-d after initial administration of vincristine， respectively. The expression levels of CSF-1 and ionized calcium-binding adapter molecule 1 （Iba1） proteins were detected by Western blot. The expression levels of CSF-1 and Iba1 mRNA were measured by RT-PCR. Results Compared with the control group， the MWT and TWL at 3-， 5- and 7-d after vincristine administration were significantly decreased in the CINP group （both P < 0.01）. The MWT and TWL at 5- and 7-d after vincristine administration in the CINP+anti group were significantly higher than those in the CINP group （both P < 0.01）. Compared with the control group， the expression levels of CSF-1 and Iba1 in the spinal cord were significantly up-regulated in the CINP group （both P < 0.01）. Compared with the CINP group， the expression levels of CSF-1 and Iba1 in the spinal cord were significantly down-regulated in the CINP+anti group （both P < 0.05）. Compared with the control group， the expression of Iba1 mRNA was significantly up-regulated in the CINP group （P < 0.01）. Compared with the CINP group， the expression of Iba1 mRNA was remarkably down-regulated in the CINP+anti group （P < 0.01）. Conclusion The mechanism of neuropathic pain induced by vincristine may be related to the activation of spinal microglia induced by CSF-1 in rats.

【Key words】Vincristine;Neuropathic pain;Microglia;Colony-stimulating factor 1

長(zhǎng)春新堿是一種常用化學(xué)治療藥物，被用于治療各種癌癥，特別是急性淋巴細(xì)胞白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。長(zhǎng)春新堿與其他化學(xué)治療藥物一樣會(huì)伴不良反應(yīng)，其中化學(xué)治療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛（CINP）最為常見(jiàn)，這是一種劑量限制性毒性[1-2]。目前用于化學(xué)治療引起CINP的治療藥物僅限于抗驚厥藥、阿片類藥物和三環(huán)抗抑郁藥，但這些藥物的應(yīng)用往往因其不可被接受的不良反應(yīng)而受限[3-4]。因此闡明CINP發(fā)生機(jī)制，對(duì)于探索藥物作用靶點(diǎn)、開(kāi)發(fā)有效的治療藥物具有重大現(xiàn)實(shí)意義。隨著對(duì)疼痛機(jī)制研究的不斷深入，細(xì)胞因子尤其集落刺激因子1（CSF-1）在CINP中的作用得到越來(lái)越多研究者關(guān)注[5-7]。近期的研究證實(shí)，在脊神經(jīng)結(jié)扎、背部痛、關(guān)節(jié)炎疼痛模型中，CSF-1在慢性疼痛信息調(diào)制中扮演重要角色，但是其在化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)CINP中的作用未見(jiàn)報(bào)道[8-10]。本研究采用長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)CINP大鼠模型，探討長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)機(jī)械痛敏和熱痛敏的可能機(jī)制。

材料與方法

一、材? 料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠30只，體質(zhì)量200～230 g，由清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（粵）2019-0206]。注射用硫酸長(zhǎng)春新堿（浙江海正藥業(yè)股份有限公司），兔抗大鼠CSF-1單克隆抗體、兔抗大鼠離子化鈣結(jié)合適配分子1（Iba1）單克隆抗體（Abcam公司，美國(guó)），PCR試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司），von Frey細(xì)絲（Stoelting公司），熱痛刺激儀（Stoelting公司），CSF-1中和抗體（Abcam公司），TRIzol? reagen（Invitrogen公司），焦碳酸二乙酯、BeyoR TTM cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司），實(shí)驗(yàn)用PCR引物（天跟生化科技北京有限公司）。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理要求。

二、方 法

1.動(dòng)物分組與處理

將30只大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，將其按隨機(jī)數(shù)表法分為3組各10只：對(duì)照組（Control組）、化學(xué)治療痛組（CINP組）、化學(xué)治療痛+CSF-1中和抗體組（CINP+anti組）。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物自由攝食和飲水，分籠單獨(dú)飼養(yǎng)， 室溫（22±1）℃， 光照周期12 h（7：00 ～ 9：00 pm 光照，19：00 ～ 7：00 黑暗）。

2. 鞘內(nèi)置管

參照Yaksh等[11]報(bào)道的方法對(duì)大鼠實(shí)施鞘內(nèi)置管， 置管成功后觀察其肢體運(yùn)動(dòng)情況， 有運(yùn)動(dòng)功能障礙大鼠將被剔除后續(xù)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)導(dǎo)管注射利多卡因后30 s內(nèi)出現(xiàn)雙后肢麻痹現(xiàn)象即確認(rèn)為導(dǎo)管位置正確，置管5 d后測(cè)試大鼠無(wú)感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)異常即可用于實(shí)驗(yàn) 。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及給藥方法

對(duì)大鼠進(jìn)行隔日腹腔注射長(zhǎng)春新堿，注射量為125 μg/kg（共計(jì) 4 次），注射當(dāng)日視為 1 d，通過(guò)檢測(cè)大鼠痛閾值變化確定化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)的CINP模型建立成功。CINP+anti組從1 d開(kāi)始連續(xù)7 d于行為學(xué)測(cè)試前30 min鞘內(nèi)給予CSF-1中和抗體（10 μg/10 μl），每次給藥后用10 μl生理鹽水沖洗聚乙烯管。

4. 行為學(xué)的測(cè)定

參照Chaplan 等[12]的方法測(cè)定機(jī)械縮足反射閾值（MWT），以Up-down法推測(cè)閾值，并在閾值上下各刺激5次，用中位數(shù)法計(jì)算50%的反應(yīng)閾值。參照Hargreaves等[13]的方法測(cè)定熱縮足反射潛伏期（TWL）， 為防止組織損傷設(shè)定自動(dòng)切斷時(shí)間為20 s。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中熱刺激強(qiáng)度保持一致，測(cè)定5次TWL（間隔3 min）取平均值。在給藥前、給藥后1、3、5、7 d分別采用MWT和TWL評(píng)價(jià)大鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏。

5. 蛋白免疫印跡法檢測(cè)脊髓CSF-1、Iba1蛋白

采用戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠后處死，取出其脊髓L4 ～ 5節(jié)段進(jìn)行勻漿（加入裂解液），于4℃下12 000轉(zhuǎn)/分離心5 min，并進(jìn)行二辛可寧酸法（BCA）蛋白定量，每份樣品各取20 μg蛋白質(zhì)。配置分離膠和濃縮膠，當(dāng)溴酚藍(lán)染料前端電泳至分離膠末端處時(shí)即停止電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉2 h， 加入β-actin（兔抗大鼠，1∶2000）、CSF-1（兔抗大鼠，1∶1000）、? Iba1（兔抗大鼠，1∶1000）一抗，4℃孵育過(guò)夜后洗膜3次（每次10 min）。加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶3000）室溫孵育后洗膜、顯色、曝光、顯影，采用Image J軟件檢測(cè)目的蛋白條帶及β-actin蛋白條帶的光密度值，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值作為目的蛋白表達(dá)量。將3張以上相同趨勢(shì)灰度值取平均值記為本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

6. 逆轉(zhuǎn)錄-PCR測(cè)定脊髓CSF-1 mRNA、Iba1 mRNA??注射長(zhǎng)春新堿后7 d，每組各取3只大鼠實(shí)施安樂(lè)死后進(jìn)行檢查。用TRIzol? reagent提取大鼠L4 ～ 6脊髓總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA。用ΔΔCT 法來(lái)測(cè)定CSF-1 mRNA、CSF-1受體mRNA、Iba1 mRNA含量。引物合成為：CSF-1上游引物：5-TGCTAAGTGCTCTAGCCGAG-3;下游引物5- CCCCCAACAGTCAGCAAGAC-3。Iba1上游引物：5-CCATGACCTTCCAAGAGAATGC-3;下游引物：5-ACCGGCTTGTGCTGTAGTC。β-actin上游引物：5-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3;下游引物：5-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min、94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。計(jì)算目的基因表達(dá)灰度/β-actin灰度值作為目的基因表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，行為學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析，同一時(shí)間點(diǎn)多重比較（Control組與CINP組;CINP組與CINP+anti組）采用Sidak法;蛋白免疫印跡、逆轉(zhuǎn)錄PCR數(shù)據(jù)結(jié)果采用單因素方差分析，多重比較（Control組與CINP組;CINP組與CINP+anti組）采用Tukey法。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、制模情況

本實(shí)驗(yàn)中的大鼠首次給藥后3 d 的MWT和TWL開(kāi)始明顯降低，并出現(xiàn)跛行、抬足、舔舐足底增多以及自發(fā)嘶叫等疼痛行為學(xué)變化，直到本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束，表明CINP模型制備成功，無(wú)被剔除的大鼠。

二、Control組、CINP組及CINP+anti組大鼠 MWT和TWL 變化情況

重復(fù)測(cè)量資料方差分析結(jié)果：時(shí)間和分組之間存在交互效應(yīng)[MWT（F = 27.11，P < 0.01）和TWL（F = 28.61，P < 0.01）]，故分析簡(jiǎn)單效應(yīng)與Control組比較，CINP組大鼠在3、5、7 d， MWT[3 d：（12.6±0.5）g，P < 0.01;5 d：（9.3±0.8）g，P < 0.01;7 d：（8.1±0.7）g，P < 0.01）和TWL[3 d： （17.1±0.6）s，P < 0.01;5 d：（15.5±0.6）s，P < 0.01;7 d：（12.9±0.7）s，P < 0.01]均降低，同時(shí)大鼠跛行、抬足、舔舐足底、自發(fā)嘶叫明顯增加。與CINP組比較，CINP+anti組大鼠在5、7 d MWT[5 d：（11.7±1.1）g，P < 0.01;7 d：（11.5±0.5）g，P < 0.01]和TWL[5 d：（17.2±0.6）s，P < 0.01;7 d：（14.8±0.5）s，P < 0.01]均升高;同時(shí)大鼠跛行、抬足、舔舐足底、自發(fā)嘶叫明顯減少，見(jiàn)圖1。

三、Control組、CINP組及CINP+anti組大鼠大鼠脊髓CSF-1和Iba1蛋白表達(dá)情況各組大鼠的CSF-1蛋白（F = 283.20， P < 0.01）和Iba1蛋白（F = 21.25， P < 0.01）表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Control組比較，CINP組脊髓CSF-1蛋白（0.85±0.10）表達(dá)上調(diào)（P < 0.01）;與CINP組相比，CINP+anti組脊髓CSF-1蛋白（0.25±0.05）表達(dá)下調(diào)（P < 0.01），見(jiàn)圖2A。與Control組相比，CINP組脊髓Iba1蛋白（0.75± 0.12）表達(dá)上調(diào)（P < 0.01）;與CINP組相比，CINP+anti組脊髓Iba1蛋白（0.53±0.06）表達(dá)下調(diào)（P = 0.012），見(jiàn)圖2B。

三、各組大鼠脊髓CSF-1、Iba1 mRNA表達(dá)情況

各組脊髓CSF-1mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 1.71，P = 0.256），見(jiàn)圖3A。各組脊髓Iba1 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 108.50，P< 0.01），與Control組比較，CINP組脊髓Iba1 mRNA表達(dá)（0.95±0.09）上調(diào)（P < 0.01）;與CINP組比較，CINP+anti組脊髓Iba1 mRNA表達(dá)（0.63± 0.06）下調(diào)（P < 0.01），見(jiàn)圖3B。

討論

本研究采用許愛(ài)軍等[14]介紹的方法制備大鼠CINP模型，該模型由于可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好、與臨床CINP特征有相似之處等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于驗(yàn)證藥物和探討機(jī)制的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。本實(shí)驗(yàn)的CINP模型制備成功。

CSF-1是一種細(xì)胞因子，它通過(guò)與Ⅲ型受體酪氨酸激酶偶聯(lián)CSF-1受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用，在調(diào)節(jié)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和分化中發(fā)揮重要作用[15]。越來(lái)越多證據(jù)顯示CSF-1在CINP中發(fā)揮重要作用[5-6]。我們的研究結(jié)果表明，與Control組比較，CINP組大鼠脊髓CSF-1蛋白表達(dá)上調(diào)，但兩者脊髓CSF-1 mRNA 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示可能存在其他部位CSF-1蛋白向脊髓轉(zhuǎn)運(yùn)的情況，本課題組（2019年）進(jìn)行的前期實(shí)驗(yàn)顯示，在構(gòu)建CINP模型前結(jié)扎L4 ～ 5背根，脊髓CSF-1降低與正常對(duì)照組無(wú)差異，也進(jìn)一步證實(shí)背根節(jié)CSF-1向脊髓轉(zhuǎn)運(yùn)。另有研究顯示缺血痛模型建立后6 h脊髓背角活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生CSF-1，相反，星形膠質(zhì)細(xì)胞代謝抑制劑氟代檸檬酸顯著抑制缺血6 h后CSF-1上調(diào)，其CSF-1產(chǎn)生部位和我們實(shí)驗(yàn)的差異可能與使用模型以及動(dòng)物種屬不同有關(guān)[16]。既然存在CSF-1向脊髓轉(zhuǎn)運(yùn)，那么CSF-1如何發(fā)揮作用？最近的研究表明，脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠背根節(jié)，可使初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元中CSF-1促進(jìn)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，以及促發(fā)促傷害性基因[8]。Iba1是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，是一個(gè)17 kDa的EF手性蛋白，在小膠質(zhì)細(xì)胞的活化過(guò)程中表達(dá)升高。在本研究中，予大鼠腹腔注射長(zhǎng)春新堿后，CINP組脊髓Iba1蛋白、Iba1 mRNA均升高，與CINP組相比，CINP+anti組脊髓Iba1蛋白、Iba1 mRNA均降低，這提示脊髓CSF-1蛋白可能活化了脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)CINP發(fā)生。

綜上所述，長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的CINP，其機(jī)制可能與脊髓CSF-1激活小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。然而在本實(shí)驗(yàn)中脊髓CSF-1蛋白表達(dá)升高是否源于背根節(jié)或其他部位的轉(zhuǎn)運(yùn)還有待今后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-01-20）

（本文編輯：洪悅民）