陳 宇 ， 杜雪曼 ， 連慧敏 ， 唐賽男 ， 劉文瀚 ， 趙菁華 ， 高 利

(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院 黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學教育部重點實驗室 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

ATP酶廣泛分布于腦組織中，有學者認為其可調節(jié)多數(shù)細胞的活性。其中Na+-K+-ATP酶主要在調節(jié)神經元信號傳導、離子穩(wěn)態(tài)、肌肉收縮等方面發(fā)揮重要作用[1]；而細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶能使胞漿內Ca2+維持細胞穩(wěn)態(tài)從而使神經系統(tǒng)功能正常。

噻拉嗪(Xylazine，2，6-二甲苯胺噻嗪)通過直接作用于α-2型腎上腺素能受體產生中樞抑制作用從而起到麻醉作用[2]。經過多年的臨床應用發(fā)現(xiàn)，噻拉嗪使用后肌松效果良好，且在安全用藥范圍內，藥物效果會隨著劑量的增加而逐步加強。而噻拉嗪對Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性變化的情況鮮有報道。因此，本試驗通過噻拉嗪對離體神經元中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的變化來探討噻拉嗪麻醉機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠30只，質量180～220 g；孕16～18 d的Wistar大鼠5只，質量230～270 g，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院動物實驗中心提供。

1.2 主要藥品與試劑 噻拉嗪，由東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院外科教研室提供；胎牛血清(FBS，16140071，Invitrogen)；青鏈霉素(15140122，Invitrogen)；胰酶(LS003707，Worthington)；Mouse anti-MAP2 antibody(13-1500)；PBS(pH值為7.4，10010-023，Gibco)；細胞裂解液(北京賽馳生物科技有限公司)；考馬斯亮蘭蛋白質含量測定試劑盒、超微量ATP酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ProLong Gold antifade(P36934,Invitrogen)。

1.3 試驗儀器 Waters 600高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱：Symmetry C18(4.6×150 mm，5 μm)；細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；離心機、血細胞計數(shù)板(湖南星科科學儀器有限公司)；高速冷凍離心機(德國Sartorius公司)；75 μm細胞濾網(昆山市超聲儀器有限公司)；手術器械，由東北農業(yè)大學外科教研室提供。

1.4 細胞培養(yǎng)及鑒定

1.4.1 神經元的培養(yǎng) 培養(yǎng)板在紫外線下照射0.5 h。隨后，培養(yǎng)板底部由足量聚左旋賴氨酸覆蓋，混勻并放置過夜。將懷孕大鼠斷頸處死，常規(guī)手術消毒，開腹，從子宮中取出胎鼠并斷頸處死，將完整腦組織放入分離培養(yǎng)液中進行皮質的分離(分離過程中需確保腦組織完全浸在分離液中)。將組織剪碎(大小約為1 mm3)后置于15 mL離心管中，待所有組織沉底后棄去85%～90%液體，然后再加入10 mL新分離液。組織沉底后棄去分離液，重復2次。將組織懸浮在4.5 mL新分離液中，加入0.5 mL胰蛋白酶液，輕柔混勻。37 ℃水浴鍋中消化5～10 min。加入接種培養(yǎng)基終止消化，用長槍頭輕柔吹打10次后1 000 r/min離心5 min。吸凈上清液后用2 mL接種培養(yǎng)基重懸細胞，洗滌2次。視消化組織黏稠程度加入0.1～0.5 mL的DNA酶，室溫處理5 min。

用長槍頭輕柔吹打組織8～10次，使細胞分散進而制得細胞懸液。將分散的細胞懸液用培養(yǎng)基進行10倍稀釋。在細胞計數(shù)板上估算活性細胞的密度。根據細胞狀態(tài)，在6孔板上加細胞，密度為105～106個/mL(須均勻接種到培養(yǎng)板上)。在細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)4 h后，從每個孔中吸出培養(yǎng)基，再向每個孔中加入2 mL 37 ℃維持培養(yǎng)基。隨后，放在細胞培養(yǎng)箱里37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。接種后2 d加入終濃度為1～5 μmol/L胞嘧啶阿糖核苷(阿糖胞苷；1-b-D阿糖呋喃胞嘧啶)來抑制非神經元增殖，1周2次，每次棄掉一半培養(yǎng)基，再加入相同體積新培養(yǎng)基。

1.4.2 神經元的鑒定 將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液緩慢吸出，然后快速加入37 ℃多聚甲醛與蔗糖的混合液1 mL，置于室溫10 min。多聚甲醛與蔗糖混合液吸出后，加入0.1%的TritonX-100 1 mL到培養(yǎng)孔中，室溫放置10 min。PBS輕柔浸洗玻片后加5%牛血清白蛋白1 mL，置于室溫1 h。在載玻片上滴加MAP-2后4 ℃過夜。用PBS浸洗載玻片3次，每次3 min，然后滴加二抗并室溫放置1 h；再用PBS浸洗載玻片3次。在一側滴入1滴抗褪色封固液(ProLong Gold antifade)，將含細胞一側向下，清除多余封固液。載玻片避光放置1 h后置于顯微鏡下觀察。

1.5 細胞給藥濃度測定 將30只Wistar大鼠隨機分為3組：低劑量組(D組)，麻醉組(M組)，高劑量組(G組)。D組腹腔注射噻拉嗪10、20、30、40 mg/(kg·bw)，M組腹腔注射噻拉嗪50、60、70、80、90、100 mg/(kg·bw)，G組腹腔注射噻拉嗪150、200、300 mg/(kg·bw)，每個濃度3個平行，心臟采血，高效液相色譜法(HPLC)檢測血藥濃度。根據噻拉嗪在大鼠血藥濃度檢出值設立濃度梯度從而確定噻拉嗪在離體培養(yǎng)神經元的藥物濃度。

1.6 樣品的采集與酶活性的檢測 根據噻拉嗪在Wistar大鼠麻醉過程中的血藥濃度檢測值，確定其作用于神經細胞的濃度為15，25，35 μg/mL和45 μg/mL。培養(yǎng)神經元第8天時加入不同濃度噻拉嗪，每個濃度做3個平行試驗。分別在加藥后0、5、10、15、20、25、30、45、60、90 min和120 min進行細胞裂解，離心后分別取上清液40 μL置于EP管中，根據試劑盒的說明書進行后續(xù)的試驗。

應用分光光度法測定Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，二者酶活性檢測均使用超微量ATP酶測定試劑盒，具體試驗步驟參照說明書。ATP可由ATP酶分解生成ADP及無機磷，因此，測定無機磷含量即可判斷ATP酶活性的高低。組織或細胞中ATP酶活性可根據下面的公式進行計算：

細胞中ATPase活性(U/mgprot)=[(測定管OD值-對照管OD值)÷(標準管OD值-空白管OD值)]×標準管濃度(0.02 μmol/mL)×6*×7.8**÷勻漿蛋白濃度(mg/mL)

*：定義上為每小時，實際操作為10 min反應；**：反應體系中7.8倍稀釋；蛋白濃度由考馬斯亮蘭法測定

1.7 數(shù)據分析與處理 試驗數(shù)據以“Mean ± SD”表示；兩變量間的簡單相關性采用直線相關回歸分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 神經元培養(yǎng)及鑒定

2.1.1 形態(tài)學觀察 細胞接種后連續(xù)8 d在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。接種3 h后可見貼壁的神經元大小均一，胞體為圓形，分散均勻，包體周圍有光暈包圍(圖1)；培養(yǎng)至第4天，從形態(tài)學上未見其他雜質細胞，神經元胞體變長，形態(tài)隨突起的方向延伸，細胞間隱約出現(xiàn)突起交織狀(圖2)；培養(yǎng)至第8天，胞體成熟，突起充分延展且清晰，特征形態(tài)明顯(圖3)。

圖2 大腦皮質神經元體外培養(yǎng)4 d (200×)

圖3 大腦皮質神經元體外培養(yǎng)8 d (200×)

2.1.2 神經元的鑒定 將培養(yǎng)第8天的神經元進行MAP-2免疫熒光鑒定。顯微鏡下觀察可見神經元呈現(xiàn)熒光綠色，其中存在大量神經元，突起清晰且延展充分、形態(tài)良好、呈現(xiàn)典型的神經元形態(tài)(見封三彩版圖4)。

2.2 不同濃度噻拉嗪對Na+-K+-ATP酶活性的影響 如表1所示，4種不同濃度噻拉嗪(15 μg/mL、25 μg/mL、35 μg/mL和45 μg/mL)使Na+-K+-ATP酶活性均呈現(xiàn)先下降后上升趨勢。25 min時，15 μg/mL，25 μg/mL和45 μg/mL 3組的Na+-K+-ATP酶活性為最低值，與0 min相比分別降低了63.72%，66.77%和64.63%(P<0.01)。隨后這3組酶活性逐漸上升，其中15 μg/mL和45 μg/mL最高值均出現(xiàn)在60 min，與25 min時相比分別升高188.9%和181.8%(P<0.01)，25 μg/mL組在120 min時最高，與25 min相比上升208.4%(P<0.01)，與0 min相比差異不顯著(P>0.05)。35 μg/mL組Na+-K+-ATP酶活性在15 min時降為最低值，下降了67.04%(P<0.01)，之后酶活性逐漸恢復，在120 min時最高，與15 min相比上升196.2%(P<0.01)，與0 min相比差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同濃度噻拉嗪對Na+-K+-ATP酶活性的影響

2.3 不同濃度噻拉嗪對Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響 如表2所示，15 μg/mL、25 μg/mL、35 μg/mL和45 μg/mL中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在不同的作用時間均受到抑制。15 μg/mL，25 μg/mL，35 μg/mL和45 μg/mL組Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在25 min時降至最低值，較0 min降低了42.81%，68.91%，87.67%和80.14%(P<0.01)。隨后Ca2+-Mg2+-ATP酶活性上升，15 μg/mL組在60 min時為最高值，與25 min相比上升46.95%(P<0.01)，與0 min比差異不顯著(P>0.05)；25 μg/mL，35 μg/mL和45 μg/mL的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均呈現(xiàn)上升趨勢，在120 min時，與最低值比分別上升了104.2%，420%和170.8%(P<0.01)。

表2 不同濃度噻拉嗪對Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

3 討論

Na+-K+-ATP酶(又稱Na+-K+泵)是一種普遍存在的P型ATP驅動陽離子轉運蛋白，它可以將2個K+和3個Na+交換出細胞，從而建立穿過質膜的細胞工作電位。這種梯度對維持神經元信號傳導、肌肉收縮具有至關的重要[3]。有學者研究認為，異氟醚、氯胺酮和氯丙嗪等麻醉藥對中樞抑制作用可能與大腦皮質內Na+-K+-ATP酶活性下降有關[4-5]。此外，胡興國等[6]研究異丙酚能使大腦皮層、腦干及海馬突觸體中的Na+-K+-ATP酶活性下降，從而發(fā)揮對中樞神經系統(tǒng)的抑制作用。同時研究表明，烏頭堿能影響離體SD大鼠腦組織細胞中Na+、K+、Ca2+、Mg2+濃度而使細胞形態(tài)發(fā)生改變以及功能受損[7]。

本試驗中，不同濃度的(15、25、35 μg/mL和45 μg/mL)噻拉嗪作用離體神經細胞后，各組Na+-K+-ATP酶活性都表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，60 min到120 min酶活性逐漸恢復至0 min時水平。25 μg/mL、35 μg/mL和45 μg/mL這3組較15 μg/mL組出現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)。有研究表明，這主要是由于藥物對Na+-K+-ATP酶的作用通過其不同亞基結構的變化來實現(xiàn)[8]，前期研究發(fā)現(xiàn)，噻拉嗪能有效抑制麻醉期鼠大腦皮質內Na+-K+-ATP酶活性，其活性變化可能與噻拉嗪麻醉效果的產生有一定關系[9]。噻拉嗪對Na+-K+-ATP酶活性的影響顯著，可能是由于中樞抑制與神經元Na+-K+-ATP酶活性變化存在著關系。

Ca2+-Mg2+-ATP酶在維持細胞內Ca2+水平發(fā)揮重要作用，神經元的活動也依賴于細胞內Ca2+水平。諸多研究表明，不同類型的麻醉藥均能使Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低從而實現(xiàn)麻醉作用[10-11]。當噻拉嗪作用濃度為15 μg/mL，作用時間10 min時，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01)，隨后逐步恢復到空白組水平，無顯著差異。25 μg/mL、35 μg/mL、45 μg/mL組的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性都表現(xiàn)為先下降后回升，25 min時噻拉嗪對酶活性的抑制作用最為明顯，活性值最低，在120 min時，其仍對神經細胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性抑制作用顯著(P<0.01)。主要是因為噻拉嗪作用于神經元后，抑制了Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，胞內Ca2+大量蓄積，穩(wěn)態(tài)失衡，使得神經細胞動作電位發(fā)生變化，從而發(fā)揮中樞抑制作用。然而隨著麻醉時間延長，藥物在神經細胞內發(fā)生代謝，藥物的有效濃度下降，對中樞抑制作用減弱。韓光[12]通過研究山羊使用噻拉嗪麻醉的藥物代謝動力學發(fā)現(xiàn)，在噻拉嗪麻醉90 min之后，山羊麻醉深度減弱，逐漸蘇醒，此時血藥濃度為56.6 ng/mL，對動物的麻醉效果較差，與本試驗的結果一致。與此同時，研究證實異氟醚可以明顯抑制丘腦皮質神經元細胞膜T-型鈣通道的峰電流[13]，隨后的生物物理學研究指出這種抑制在細胞膜去極化時更易發(fā)生。

4 結論

噻拉嗪通過顯著降低Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性來發(fā)揮麻醉作用，其作用機制可能與改變神經元胞內外的離子平衡狀態(tài)有關。