曹 雷 , 崔曉辰 , 于志海 , 胡士林

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 , 山東 濰坊 261061 ; 2.濰坊科瑞斯生物科技有限公司 , 山東 濰坊 261061)

A群牛輪狀病毒腹瀉是由A群牛輪狀病毒(BRV)引起的，主要以仔牛厭食、嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂為特征癥狀的疾病，給畜牧業(yè)帶來嚴重危害，消滅和控制該病已成為世界各國共同關注的課題。

膠體金免疫層析技術(GICA)是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術，目前用于檢測BRV抗原的研究在國內尚未見報道。本試驗在制備輪狀病毒單克隆抗體的基礎上，用膠體金標記單克隆抗體，制備了A群牛輪狀病毒免疫膠體金抗原檢測試紙條，并初步進行應用?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞及實驗動物 A群牛輪狀病毒、SP2/0骨髓瘤細胞均為本實驗室保存。

1.2 主要試劑 氯金酸；HT、HAT、PEG-1 500及羊抗鼠IgG二抗；硝酸纖維素膜、吸水紙和玻璃纖維。A群牛輪狀病毒(BRV)標準陽性血清為本實驗室保存。

1.3 免疫用抗原制備 將BRV病毒OSU接種的MA-104細胞培養(yǎng)物反復凍融3次后，以8 000 r/min(4 ℃)離心30 min，而后取上清32 000 r/min超速離心2.5 h，棄上清，用PBS緩沖液浸泡沉淀，4 ℃過夜，期間反復吹打使其完全溶解。次日經(jīng)不連續(xù)蔗糖密度梯度離心(32 000 r/min離心2.5 h)棄上清，吸取各層懸液以PBS緩沖液懸浮，32 000 r/min超速離心3 h脫糖，棄上清，用PBS緩沖液溶解沉淀。電鏡觀察鑒定，紫外分光光度計測定蛋白含量，作為免疫原，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠免疫 將純化的BRV抗原加入等量的弗氏完全佐劑，用注射器充分乳化，腹腔注射6～8周齡的BALB/c 小鼠，每次免疫劑量約0.1 mL/只,第14、28天用弗氏不完全佐劑充分乳化的抗原進行第2次、第3次免疫，劑量同第1次。10 d后斷尾采血，間接ELISA法測其抗體效價并建立檢測方法。取抗體水平達到1 ∶10 000以上的小鼠用BRV抗原進行腹腔及尾靜脈加強免疫，3 d后取其脾細胞進行融合。

1.5 單克隆抗體的制備 采用常規(guī)方法進行細胞融合，有限稀釋法克隆3次，間接ELISA法篩選陽性克隆，參照文獻[1-2]進行。

1.6 標準陽性血清的純化 由本實驗室保存的BRV標準陽性血清采用飽和硫酸銨沉淀-透析法純化，間接ELISA法檢測抗體效價。

1.7 膠體金的制備 參照文獻[3-4]，氯金酸1 g裝，加三蒸水(電導率0.3 US/cm)定容至100 mL，室溫下溶解0.22 μm膜過濾，置4 ℃?zhèn)溆?。?% 氯金酸溶液1 mL，三蒸水稀釋至100 mL煮沸2 min后，在劇烈攪拌下，快速加入2 mL新配的1%檸檬酸鈉溶液(37 ℃ 預溫)，溶液由無色-藍色-淺藍色-紫色，當氯金酸變?yōu)樯罴t色后繼續(xù)煮沸6～8 min,至適宜濃度(OD525 nm值0.9312)或用蒸餾水調節(jié)OD值，冷卻后加入三蒸水恢復到原體積，用0.2 mol/L碳酸鉀調pH值至7.2～7.5(中性)。用0.22 μm 濾膜無菌注射器壓濾后置4 ℃保存。

1.8 金標單抗的制備 將待標記BRV單抗倍比稀釋，分別取100 μL加入到1 mL膠體金中，10 min后加入10%NaCl 100 μL,4 ℃靜止1 h。對照管(未加蛋白質)和加入蛋白質的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1 mL膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質用量，即為該標記蛋白質的最低用量，在實際工作中，可適當增加10%～30%即為穩(wěn)定1 mL膠體金所需蛋白質實際用量。同法對金標單抗最適pH值進行測定。取一定量膠體金溶液用0.2 mol/L K2CO3調最佳pH值，按最佳標記量加入BRV單抗，室溫作用30 min，加入Tris-Cl(pH值8.0，20 mmol/L)配制的BSA使終濃度為1%，4 ℃靜止2 h后使用[5]。

1.9 金標單抗的純化 將金標抗體復合物以1 200 r/min離心30 min，棄沉淀將上清轉移到另一離心管中(切忌傾倒)，12 000 r/min離心30 min棄上清，沉淀用1%BSA(Tris-HCI pH值8.0, 20 mmol/L配制)洗2遍，用1%BSA溶解沉淀并濃縮為原體積1/10(即5 mL),0.5 mg/mL疊氮鈉防腐，用0.45 nm濾膜過濾，4 ℃冰箱保存。

1.10 膠體金試紙條的制備 金標單抗做一定倍數(shù)稀釋后，應用XYZ-3000三維噴點儀中的Airjet噴制金標墊。純化的標準陽性血清用于檢測線(T)的顯示，羊抗鼠IgG二抗用于質控線(C)的顯示。NC膜放于XYZ-3000三維噴點儀平臺上，標準陽性血清稀釋后放于樣品池B，羊抗鼠IgG二抗稀釋后放于樣品池C。開機后用Biojet1和B、C樣品池中的樣品分別點射于膜上形成2條線，置室溫自然干燥。將金標墊、NC膜、樣品墊及吸水濾紙按照圖1平貼于PVC支持板上，切成0.4 cm×10 cm的試紙條，加干燥劑密封保存。

圖1 膠體金免疫層析示意圖

1.11 判定標準 取待檢樣品100 μL滴加在樣品墊上，10 min內觀察結果。如果在檢測線(T)和質控線(C)上出現(xiàn)2條紅線，表示為陽性結果；如果只在對照線(C)上出現(xiàn)1條紅線，表示陰性結果；若沒有紅線出現(xiàn)表示該試驗失敗，需重新檢測。

1.12 敏感性檢驗 將純化的牛輪狀病毒10倍梯度稀釋到最低濃度為每毫升幾十納克，以此為樣品各取100 μL檢測，得出所能檢出的最低病毒量。同時用韓國進口的BRV抗原快速檢測試劑盒對樣品進行同步檢測，與本試驗制備的試紙條敏感性進行比較。

1.13 特異性檢驗 分別取牛輪狀病毒、冠狀病毒等抗原進行檢測，觀察結果。

1.14 現(xiàn)地試驗 對上海、廣州、內蒙古、遼寧、河南等地牛場送檢的37份糞便病料進行處理，用試紙條檢測。同時用常規(guī)RT-PCR方法和BRV抗原快速檢測試劑盒檢測，比較三者檢測結果。

2 結果

2.1 細胞融合與克隆 用50%PEG-1 500做融合劑，采用傳統(tǒng)方法將免疫BRV小鼠脾細胞和處于對數(shù)生長期的SP/0骨髓瘤細胞進行融合。融合后第3天，可見單個雜交瘤細胞分裂5～7個不等的細胞集落；第10天雜交瘤細胞集落占培養(yǎng)孔的50%。細胞融合率可達100%，用建立的間接ELISA法共檢出陽性克隆20株，陽性率為20%。對陽性孔進行擴大培養(yǎng)和亞克隆，最終獲得5株能夠穩(wěn)定分泌抗BRV單克隆抗體的雜交瘤細胞系，分別命名為1D5，1B5，1G9，1C7和3C10。

2.2 BRV單克隆抗體的鑒定 間接ELISA檢測其細胞培養(yǎng)上清效價分別為1 ∶40，1 ∶40，1 ∶320，1 ∶160和1 ∶160，腹水效價分別為1 ∶800，1 ∶3 200，1 ∶12 800，1 ∶6 400和1 ∶3 200。亞型鑒定結果顯示，1D5，1B5和1C7為IgM型，1G9和3C10為IgG2b型，其輕鏈均為κ鏈(見封二彩版圖3)。Western Blot試驗表明，1D5，1G9和1C7能夠與BRV VP6蛋白發(fā)生特異性反應，1B5和3C10能夠特異的與BRV VP7發(fā)生反應(見封二彩版圖2)。我們選擇效價較高的1G9單克隆細胞株大量制備腹水，并用飽和硫酸銨沉淀-透析法進行純化，最終獲得單抗蛋白量為6.345 mg/mL。

2.3 膠體金標記抗體最適穩(wěn)定量的測定 根據(jù)待標記抗體蛋白的要求，將膠體金調pH值9.0左右，分裝11管，每管1 mL。將抗體以0.005 mol/L NaCl做系列稀釋，另設2管對照(表1)。試驗觀察結果：待標抗體96倍稀釋時達到最低穩(wěn)定量，此時抗體蛋白濃度為66.1 μg/mL，即金標抗體最適穩(wěn)定量為8.57 μg/mL膠體金。將未標記的膠體金顆粒與標記后的金顆粒進行光度掃描，未標記的膠體金顆粒最大吸光值在525 nm，而標記后的最大吸光值在530 nm，最大吸光值增大了5 nm，說明膠體金顆粒表面成功附著了蛋白，成功標記。

表1 膠體金標記抗體最適穩(wěn)定量的測定

2.4 膠體金標記抗體最適pH值的測定 取膠體金溶液100 μL，以0.2 mol/L K2CO3將pH值調為10、9.6、9.3、9.0、8.6、8.3、8.0，另設一管對照(表2)。根據(jù)已測定金標抗體最適穩(wěn)定量調節(jié)待標抗體濃度，各取10 μL加到上述膠體金溶液中混勻。5 min后，在上述各管中除對照管各加入10 μL 10%NaCl溶液，混勻后靜置2 h，觀察結果，保持紅色的最低pH值為9.0。

表2 膠體金標記抗體最適pH值的測定

2.5 硝酸纖維膜封閉液的選擇及濃度確定 以BSA、脫脂乳2種溶液為備選材料，依據(jù)金標復合物通過硝酸纖維膜時間和反應后背景顏色為標準，時間短且背景淺為最佳(表3)。本試驗選擇3% BSA為封閉液。

表3 硝酸纖維素膜封閉液的選擇及濃度確定

2.6 高免陽性血清及羊抗鼠IgG二抗包被濃度確定 用pH值8.0, 20 mmol/L的Tris -HCl緩沖液稀釋A群牛輪狀病毒標準陽性血清，以10 μg/mL的間隔，50 μg/mL到100 μg/mL，印跡于硝酸纖維素膜上(檢測點)，以0.8 mg/mL的羊抗鼠IgG抗體印跡于硝酸纖維素膜上(質控點)，制作成試紙條，對不同稀釋濃度的A群牛輪狀病毒做方陣試驗，確定A群牛輪狀病毒標準陽性血清的最適印跡量為62.5 μg/mL(表2)。同時，用最適濃度的A群牛輪狀病毒標準陽性血清印跡于硝酸纖維素膜上作為檢測點，以同樣方法確定羊抗兔IgG抗體的最適印跡量，結果同表4相近，約為80 μg/mL。

表4 多抗最適印記量選擇

2.7 金標單抗包被濃度確定 將金標單抗溶液用Tris-Cl緩沖液按1、2、4、8倍梯度稀釋，分別包被玻璃纖維膜。對不同稀釋濃度的同一批A群牛輪狀病毒做方陣試驗，根據(jù)反應結果，確定金標單抗2倍稀釋為最佳(表5)。

表5 不同稀釋度的金標單抗與不同稀釋度BRV的方陣試驗

2.8 試紙條的組裝及檢測結果 用純化的1G9小鼠腹水單抗制備金標單抗，組裝試紙條。在樣品墊上滴加約100 μL樣品，10 min后觀察，結果如中插彩版圖4。由封二彩版圖4可見，含有BRV抗原的陽性樣品在試紙條檢測線(T)和質控線(C)處分別出現(xiàn)1條紅色線；未接BRV抗原的陰性樣品只在試紙條質控線(C)處出現(xiàn)1條紅線。

2.9 試紙條的敏感性及特異性試驗 如表6所示，該試紙條的最低檢出量約為5.341 μg/mL。與韓國進口BRV抗原快速檢測試劑盒相比：抗原濃度為5.341 μg/mL樣品的試劑盒檢測結果比試紙條要明顯些，但在抗原濃度為5.341×10-1μg/mL時檢測結果均為陰性。這說明該試紙條敏感性稍差于國外進口試劑盒。用牛冠狀病毒及Tris-Cl緩沖液等進行特異性試驗，只有BRV樣品呈現(xiàn)陽性，即該試紙條具有良好的特異性。

表6 試紙條敏感性試驗結果

2.10 試紙條穩(wěn)定性試驗 該試紙條至于室溫下、60 ℃溫箱及4 ℃冰箱各保存20 d，再用含有BRV抗原的樣品進行檢測，結果無明顯差異。

2.11 現(xiàn)地試驗 對地方牛場送檢的37份糞便病料進行了試紙條檢測，同時與常規(guī)RT-PCR方法和BRV抗原快速檢測試劑盒相比較,結果如表7,在37份待檢病料中，試紙條方法檢出11份為陽性，常規(guī)RT-PCR方法檢出17份陽性，BRV抗原快速檢測試劑盒檢出12份陽性。其中，內蒙古、遼寧和河南等地牛場的7份病料病毒含量比較高，3種方法均檢為陽性；而廣州某牛場的13份病料中，常規(guī)RT-PCR方法檢出2份為陽性，且病毒含量很低，其他二種方法未檢出。這說明本試驗制備的膠體金免疫層析試紙條比較可靠。

表7 現(xiàn)地試驗結果

3 討論

國外Engler及Putalun分別研究了檢測白喉毒素等成分的免疫層析試紙條[8-9]；寵物疾病免疫層析試紙條診斷方法已經(jīng)得到推廣[10],國內黃印堯、于相龍等人分別研制了檢測牛瘟和鵝細小病毒的膠體金試紙條[11-12]。這為膠體金技術成功應用于動物疾病診斷提供了堅實基礎。本試驗結合單克隆抗體技術和膠體金免疫層析技術，于國內首次研制出A群牛輪狀病毒膠體金免疫層析快速診斷試紙條，為提前預防和控制A群牛輪狀病毒腹瀉暴發(fā)提供強有力手段。該試紙條具有微量、敏感、特異、快速、簡便等特點，全過程只需10 min左右，無需任何輔助設備，非常適合現(xiàn)地檢測，為廣大畜主提供了一種前所未有的診斷方法,方便了疫病檢測,提高了養(yǎng)殖的技術水平,促進了養(yǎng)殖經(jīng)濟的發(fā)展。

目前，國內外關于輪狀病毒單克隆抗體的研究已有相關報道。有報道指出，針對于G3血清型輪狀病毒株VP7蛋白不同抗原決定簇的兩株單克隆抗體只能對G3血清型的輪狀病毒起到保護作用[6]，即輪狀病毒單克隆抗體不同血清型之間交叉保護性較弱；而針對于群抗原VP6蛋白的單克隆抗體對群內其他毒株的同樣起到保護作用[7]，即輪狀病毒單克隆抗體具有群特異性。A群牛輪狀病毒屬于A群、G5血清型輪狀病毒，是典型的輪狀病毒，各牛場感染率幾乎最高。本試驗利用實驗室現(xiàn)有的BRV，建立能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，為BRV膠體金快速診斷試劑盒的研制提供特異、敏感、穩(wěn)定的診斷試劑。