楊瑞梅 ， 李桂梅 ， 秦志華 ， 單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

非洲豬瘟(簡稱非瘟)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率高，死亡率可達(dá)100%[1]。自2018年我國報(bào)道首例非洲豬瘟病例以來，形成了較大污染面，疫情傳入和傳播渠道多，對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響[2]。由于該病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)機(jī)體免疫機(jī)制不完全清楚，該病目前沒有有效疫苗，因此消滅非洲豬瘟病豬，殺滅環(huán)境中非瘟病毒，阻斷傳播，是目前防治該病的重要方法。可用消毒劑殺滅豬場中非瘟病毒，已報(bào)道有多種消毒劑可用來殺滅非瘟病毒[3-5]。但這些研究都是在實(shí)驗(yàn)室中模擬條件下進(jìn)行的，豬場現(xiàn)場消毒及其效果目前報(bào)道很少。消毒劑的濃度、作用時(shí)間，消毒的程序都會(huì)影響到消毒效果。對(duì)非洲豬瘟后怎樣消毒、消毒后效果檢測，是每一個(gè)非瘟后準(zhǔn)備恢復(fù)生產(chǎn)的豬場非常關(guān)心的問題，本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[6-7]中非瘟后的消毒設(shè)計(jì)了中小規(guī)模豬場非瘟后消毒程序，應(yīng)用于江蘇某非瘟后豬場，并對(duì)每一消毒環(huán)節(jié)進(jìn)行消毒效果檢測，來了解中小規(guī)模豬場非瘟消毒程序及其效果，以期為指導(dǎo)養(yǎng)殖場科學(xué)規(guī)范開展消毒工作，切斷動(dòng)物疫病傳播途徑。

1 材料方法

1.1 材料 滅菌生理鹽水、棉簽、拉鏈?zhǔn)阶苑獯?、防護(hù)服、鞋套、Eppendorf管、氫氧化鈉、次氯酸鈉、過硫酸氫鉀、火焰噴燈、甲醛、高錳酸鉀、營養(yǎng)瓊脂、噴霧器等。

1.2 豬場概況 江蘇蘇北某豬場，自繁自養(yǎng)，母豬50頭，2019年7月15日出現(xiàn)非洲豬瘟，確診后7月20日做全場清群。

1.3 消毒方法

1.3.1 清掃前采樣和檢測 穿著防護(hù)服、鞋套等采樣，人員進(jìn)出時(shí)及時(shí)規(guī)范消毒。全面采樣，包括死角、料槽底部等不宜采集到的位置。將5 cm×5 cm的滅菌規(guī)格板放在物體表面(包括地面、墻壁、圍欄、漏縫地板、料槽、排污溝等)，用浸有無菌生理鹽水的棉拭子(或含相應(yīng)中和劑的棉拭子)1支，來回均勻涂滿整個(gè)方格，并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，每個(gè)棉拭子采樣1個(gè)方格，將棉拭子放入10 mL生理鹽水采樣管中。連續(xù)采樣5個(gè)規(guī)格板。

將放有棉拭子的采樣管充分震蕩，用無菌吸管吸取1 mL待檢樣品接種于滅菌平皿中，每個(gè)樣本接種2個(gè)平皿，如污染嚴(yán)重，可10倍遞增稀釋。將已融化的45 ℃左右的營養(yǎng)瓊脂侵入平皿，每皿約15 mL，并立即旋搖平皿，冷凝后置(36±1) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)[8]。

細(xì)菌總數(shù)(CFU/cm2)=(平板上平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))÷25

ASFV核酸檢測：采用磁珠法提取樣品DNA，用熒光定量PCR方法檢測ASFV核酸，參照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)方法進(jìn)行[9]。判定標(biāo)準(zhǔn)為陰性樣品和空白對(duì)照的Ct值>40.0，陽性檢測樣品和陽性對(duì)照的Ct值<40.0。

1.3.2 豬舍內(nèi)清洗消毒 遵循“清掃前消毒-清掃沖洗-再消毒”的原則。(1)清掃前消毒：先用消毒劑噴灑，以免病原隨浮塵或附著物污染其他物品。用5%燒堿噴灑地面、圍欄、墻壁、屋頂、通道及設(shè)施設(shè)備等，表面噴濕，有水流下為止。2 h后清掃。(2)清掃：徹底清除排泄物、墊料和剩余飼料，確保清掃干凈。圍欄、料槽、墊板、網(wǎng)架等設(shè)備盡可能的拆下到舍外進(jìn)行消毒。(3)沖洗：先浸泡后沖洗。先用消毒藥水對(duì)高床、墊板、欄桿、地面、墻壁和其他設(shè)備充分噴濕浸泡，1 h后高壓熱水沖洗干凈，水溫在70 ℃或以上(除去所有的油脂痕跡)。對(duì)拆下的各種設(shè)備，可在舍外用較大的池子，放5%的火堿進(jìn)行浸泡3 h。不能拆卸的漏縫地板等，用刷子或鋼絲球等將縫隙中的糞污等清理干凈，高壓水槍沖洗。

沖洗合格的標(biāo)準(zhǔn)為：地面、墻壁、縫隙、料槽、圍欄無糞渣、剩料殘?jiān)推渌畚?。糞溝內(nèi)無可視糞便；料管表面及圍欄和風(fēng)機(jī)百葉無灰塵和污物。

檢測細(xì)菌總數(shù)和ASFV核酸。

1.3.3 消毒 用消毒劑對(duì)舍內(nèi)全面消毒。(1)3%NaOH：地面、墻壁、通道、排污溝、設(shè)備、用具，包括漏縫地板背面，噴灑至物體表面徹底濕潤，2 h后再噴灑1次，作用4 h，然后用水沖洗。自然干燥2～3 d，檢測消毒效果。(2)5%次氯酸鈉溶液：同3%NaOH消毒步驟，檢測消毒效果。(3)1∶100過硫酸氫鉀溶液：同3%NaOH消毒步驟，檢測消毒效果。(4)火焰噴槍灼燒：火焰灼燒的部位必須提前完全干燥。對(duì)可承受耐火焰的地面及墻壁等物體進(jìn)行火焰消毒，表面光滑的物體燒3～5 s；粗糙的地面或區(qū)域15～30 s。檢測消毒效果。(5)白化：用5%NaOH+20%石灰水，對(duì)墻壁、圍欄、豬舍內(nèi)過道、排污溝、地面高壓水槍噴灑。檢測消毒效果。(6)熏蒸消毒：按28 m3的空間用500 mL 40%福爾馬林倒入200 g高錳酸鉀中，隨后封閉24 h，開門窗通氣8 h。檢測消毒效果。(7)空舍：打開門窗空舍10 d。檢測消毒效果。

2 結(jié)果

2.1 消毒后豬舍內(nèi)細(xì)菌總數(shù)檢測 對(duì)該非瘟后豬場全場豬清群后，進(jìn)行了清掃前的消毒-清掃沖洗-消毒等措施，細(xì)菌總數(shù)檢測結(jié)果表明(見表1)，清掃沖洗后墻壁、地面等的細(xì)菌總數(shù)減少了70%～80%。3% NaOH噴灑消毒，沖洗后，細(xì)菌總數(shù)急劇減少，如墻壁減少了104倍，由1 009×104CFU/cm2到1 000 CFU /cm2。5%次氯酸鈉溶液、1∶100過硫酸氫鉀溶液作用后，細(xì)菌總數(shù)都明顯減少。火焰灼燒后，墻壁、地面、漏縫地板、排污溝有少量細(xì)菌；食槽、圍欄上無細(xì)菌。白化處理后，處理表面細(xì)菌數(shù)量極少，已完全達(dá)到豬舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。用甲醛熏蒸后，環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量更少，僅在漏縫地板和排污溝中2 CFU /cm2，其余未檢測到細(xì)菌?？丈?0 d后細(xì)菌數(shù)量略有增加，但在環(huán)境合格范圍內(nèi)。

表1 豬舍內(nèi)細(xì)菌總數(shù)檢測結(jié)果

2.2 消毒后豬舍內(nèi)ASFV熒光定量PCR檢測 ASFV熒光定量PCR檢測結(jié)果(見表2)：消毒前，環(huán)境中ASFV陽性，Ct值為23～26。清掃沖洗后ASFV數(shù)量減少，但仍能檢出，經(jīng)過3%NaOH、5%次氯酸鈉溶液、1∶100過硫酸氫鉀溶液作用后，除排污溝Ct值為36外，其余ASFV核酸檢測均為陰性?；鹧孀茻螅麄€(gè)豬舍環(huán)境中ASFV核酸檢測均為陰性。之后經(jīng)過熏蒸消毒和空舍10 d，核酸檢測仍為陰性。

表2 豬舍內(nèi)ASFV熒光定量PCR檢測結(jié)果

消毒檢測結(jié)果表明，經(jīng)過這個(gè)消毒程序，環(huán)境細(xì)菌總數(shù)降到了很低水平，環(huán)境中的非洲豬瘟病毒完全清除，取得了較好的消毒效果。

3 討論

豬場發(fā)生非洲豬瘟后，為清除環(huán)境中非洲豬瘟病毒，進(jìn)行全面徹底的消毒是必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)。消毒的程序和消毒劑的選用、作用時(shí)間等都與消毒效果有密切關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)合非瘟病毒和該病流行病學(xué)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的消毒程序，并進(jìn)行了消毒效果檢測，以期為臨床非瘟恢復(fù)生產(chǎn)提供借鑒。

本試驗(yàn)表明，用“清掃前消毒-清掃沖洗-再消毒”的方案是科學(xué)合理的方法。未進(jìn)行任何處理時(shí)，地面大腸桿菌為5 100×104CFU /cm2，經(jīng)過了清掃前消毒、清掃、熱水沖洗后地面大腸桿菌降為1 300×104CFU /cm2，細(xì)菌數(shù)減少了近80%。表面機(jī)械性清掃、沖洗污物，有效降低環(huán)境中細(xì)菌含量，是使用消毒劑前的重要環(huán)節(jié)。因?yàn)樗行Ы档土擞袡C(jī)物，便于消毒劑發(fā)揮作用。清掃沖洗后應(yīng)用了多種消毒劑和消毒方法，以便徹底殺滅環(huán)境中的非洲豬瘟病毒。首先用了3% NaOH作用后，細(xì)菌總量急劇降低，如墻壁表面細(xì)菌數(shù)量降低了10 000倍，到了1 000 CFU/cm2，5%次氯酸鈉溶液作用后降到300 CFU /cm2， 1∶100過硫酸氫鉀溶液作用后降到50 CFU /cm2，此時(shí)已符合環(huán)境中細(xì)菌總數(shù)指標(biāo)，而此時(shí)ASFV的熒光PCR檢測，僅排污溝Ct值為36，其他均為陰性。之后再火焰徹底灼燒地面、墻壁、漏縫地板及背面等，再用白化即生石灰+火堿對(duì)墻面和過道高壓噴灑，最后甲醛熏蒸，舍內(nèi)非洲豬瘟病毒檢測為陰性。

發(fā)生ASFV時(shí)常用消毒劑為過硫酸氫鉀、戊二醛類、過氧乙酸等，因能高效殺菌，無毒無害，最終降解為水、氧氣、CO2等，屬環(huán)境友好型，并且過硫酸氫鉀、過氧乙酸在低溫下有效，因此防治非瘟可以選用。NaOH、生石灰等強(qiáng)堿類價(jià)格便宜，消毒高效，也被廣泛使用。其他消毒劑包括：季銨鹽類如新潔爾滅、含氯消毒劑如次氯酸鈉、含碘類消毒劑均可使用。購買正品消毒劑，按照說明書比例正確配置濃度，保證作用時(shí)間，將會(huì)取得較好的消毒效果[10-11]。

因ASFV多用豬肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)，不易獲得，并且在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，易受環(huán)境中其他因素影響。檢測環(huán)境中是否還有ASFV，目前主要采用豬場環(huán)境衛(wèi)生指標(biāo)結(jié)合ASFV熒光定量PCR檢測，2個(gè)指標(biāo)合格的方法進(jìn)行。豬場環(huán)境衛(wèi)生指標(biāo)在達(dá)到細(xì)菌總數(shù)<200 CFU /cm2為合格[12]。當(dāng)環(huán)境中細(xì)菌總數(shù)指標(biāo)達(dá)標(biāo)時(shí)，因?yàn)榻?jīng)過多次沖洗，ASFV熒光定量PCR檢測也為陰性。兩者有較好的一致性，但是能否以細(xì)菌總是代替ASFV核酸檢測還需后期大量試驗(yàn)驗(yàn)證。