楊 敬， 翁秀芳， 梁智輝， 吳雄文

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，武漢 430030

pMHC二聚體由MHC的重鏈與免疫球蛋白IgG Fc重組在一起，通過(guò)IgG Fc段的鏈間二硫鍵的作用而形成pMHC二聚體[1-2]，由于其能與T細(xì)胞受體(TCR)高親和力結(jié)合[3]，已經(jīng)成為檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的有效工具[4]。

在我們的前期工作中，已成功構(gòu)建重組HLA-A2二聚體的真核表達(dá)載體pcDNA3.1+[HLA-A2/IgG1]，表達(dá)載體中含有HLA-A2 α1-α3區(qū)與人IgG1重鏈CH1-CH3區(qū)的融合基因，并轉(zhuǎn)染721.221細(xì)胞獲得可表達(dá)HLA-A2-IgG1 Fc融合蛋白的7A2D細(xì)胞株。HLA-A2-IgG1 Fc融合蛋白由于含有IgG1 Fc段不僅可通過(guò)IgG1 Fc段的鏈間二硫鍵形成HLA-A2二聚體，而且還可借助IgG1 Fc段與金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)的高親和力結(jié)合實(shí)現(xiàn)SPA親和層析純化[5]。

可溶性表達(dá)蛋白純化過(guò)程復(fù)雜，目前常用的純化方法主要有親和層析、凝膠過(guò)濾層析和離子交換層析等。親和層析通過(guò)SPA與抗體Fc段，或者抗體與抗原的特異性結(jié)合，能使混有大量雜蛋白的目的蛋白高效純化[6]。但是親和層析的洗脫條件pH值較低，構(gòu)象不穩(wěn)定的蛋白在該條件下易發(fā)生構(gòu)象改變，導(dǎo)致功能喪失。凝膠過(guò)濾層析主要依據(jù)不同蛋白的分子量差別實(shí)現(xiàn)分離，而離子交換層析主要依據(jù)蛋白的等電點(diǎn)應(yīng)用不同pH值的緩沖液實(shí)現(xiàn)分離純化，兩者對(duì)蛋白構(gòu)象影響較小，但是凝膠過(guò)濾層析濃縮純化蛋白的效率低于離子交換層析。由于HLA-A2二聚體上的HLA-A2分子由鏈、2m和抗原肽通過(guò)非共價(jià)連接結(jié)合在一起，易于解離變性，構(gòu)象相對(duì)不穩(wěn)定。SPA親和層析純化方法中低pH值洗脫液可能導(dǎo)致HLA-A2二聚體變性，從而限制了二聚體制備效率。因此，本研究探索洗脫條件相對(duì)溫和的離子交換層析法在純化HLA-A2二聚體中的應(yīng)用，以建立高效的HLA-A2純化方法，獲得高純度并保持天然構(gòu)象與功能的HLA-A2二聚體。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 721.221細(xì)胞[7]：為B細(xì)胞轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞系，HLAⅠ類(lèi)抗原表達(dá)缺陷，同時(shí)不表達(dá)IgG1重鏈，但高表達(dá)HLAⅠ類(lèi)分子輕鏈2m，作為本實(shí)驗(yàn)HLA-A2二聚體的表達(dá)細(xì)胞與陰性對(duì)照。7A2D細(xì)胞：成功轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+[HLA-A2/IgG1]并穩(wěn)定表達(dá)HLA-A2二聚體的細(xì)胞，其中表達(dá)載體中含有HLA-A2 α1-α3區(qū)與人IgG1重鏈CH1-CH3區(qū)的融合基因，該HLA-A2二聚體上所有組成片段包括抗原肽均為人體來(lái)源的組分。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)抗體 單克隆抗體W6/32：鼠抗人HLAⅠ類(lèi)分子構(gòu)象依賴(lài)性單克隆抗體，為小鼠雜交瘤細(xì)胞系HB-95所分泌的IgG抗體，識(shí)別HLAⅠ類(lèi)分子重鏈與輕鏈結(jié)合后形成的重鏈α2-α3區(qū)特定表位，不與單獨(dú)的輕鏈或重鏈結(jié)合[8]，濃度為0.5 mg/mL，由本實(shí)驗(yàn)室陸盛軍博士制備。兔抗人2m抗體：可與2m結(jié)合，購(gòu)自Beckman公司。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司，推薦效價(jià)為1∶2500～1∶20000。

1.1.3 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑：RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗(青霉素、鏈霉素)、100×非必需氨基酸(Hyclone，美國(guó))；親和層析試劑：葡萄球菌蛋白A凝膠(Invitrogen公司)；離子交換層析試劑：DE52纖維素(Whatman公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 7A2D細(xì)胞表達(dá)的HLA-A2二聚體的收集應(yīng)用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液大量擴(kuò)增7A2D細(xì)胞，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞按照1×106/mL的密度接種到含有1%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，收集獲得2 L富含HLA-A2二聚體的表達(dá)上清。

1.2.2 HLA-A2二聚體的ELISA鑒定 用包被液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH=9.6)將W6/32稀釋至10 μg/mL，4℃濕盒中包被過(guò)夜；棄去包被液，每孔加滿3%BSA-PBS的封閉液，4℃濕盒中封閉過(guò)夜；棄去封閉液，每孔加滿洗滌液(0.05吐溫20%-PBS)，洗滌3～6次，控干；每孔加入不同稀釋倍數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)上清100 μL，37℃孵育1 h，同上法洗3～6次，控干；每孔加入1∶2500稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG的抗體100 μL，37℃孵育1 h，同上法洗3～6次，控干；每孔加50 μL新鮮配制的顯色液(OPD)，室溫顯色15 min；每孔加50 μL終止液(2 mol/L H2SO4)，終止反應(yīng)；于酶標(biāo)儀上測(cè)量各孔490 nm處的吸光度A值。

1.2.3 HLA-A2二聚體的Western blot鑒定 分別配制12%的還原型SDS-PAGE分離膠與12%非還原型PAGE分離膠。將含有HLA-A2二聚體的上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。并通過(guò)轉(zhuǎn)膜將還原型SDS-PAGE與非還原型SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜放入裝有封閉液的袋子中，置4℃中封閉過(guò)夜；用PBS洗液洗膜3次；將HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體以1∶2500的比例用封閉液稀釋?zhuān)瑢⑾跛崂w維素膜置于其中，4℃孵育過(guò)夜；棄去含一抗的封閉液，用PBS洗液洗膜3次；將洗好的膜置于DAB顯色液中，輕搖硝酸纖維素膜，觀察顯色程度，顯色應(yīng)在5～30 min內(nèi)完成；用雙蒸水洗膜終止顯色反應(yīng)，掃描顯色結(jié)果。

1.2.4 HLA-A2二聚體的濃度測(cè)定 利用已知濃度的HLA-A2分子(1 mg/mL)作為標(biāo)準(zhǔn)品，與7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清同時(shí)進(jìn)行ELISA檢測(cè)，檢測(cè)與計(jì)算7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清中HLA-A2二聚體的濃度。其中包被抗體為構(gòu)象依賴(lài)性的W6/32，檢測(cè)抗體為兔抗人β2m抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體。根據(jù)不同稀釋度的HLA-A2標(biāo)準(zhǔn)品的A490值做標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算待測(cè)樣品中HLA-A2二聚體的含量。

1.2.5 SPA親和層析法純化HLA-A2二聚體 本研究所表達(dá)的HLA-A2二聚體含有人IgG1的Fc段，與蛋白A有高親和力的結(jié)合，可通過(guò)蛋白A親合層析柱濃縮純化。將收集的300 mL 7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清用濾紙過(guò)濾去除沉淀；取3 mL蛋白A凝膠加入5 mL體積的層析柱中，并置于4℃層析柜中；用結(jié)合緩沖液(0.1 mol/L PBS，pH=7.0)以1 mL/min的速度，平衡蛋白A層析柱，平衡30 min；將過(guò)濾好的樣品以1 mL/min的速度經(jīng)過(guò)蛋白A層析柱，使樣品中的HLA-A2二聚體與蛋白A充分結(jié)合；當(dāng)樣品過(guò)濾完后，用結(jié)合緩沖液再次過(guò)柱，以洗滌未結(jié)合于蛋白A上的其它雜蛋白，流速為1 mL/min；用Brodford液檢測(cè)，直至流出的液體不再檢測(cè)得到蛋白；將結(jié)合緩沖液更換為洗脫緩沖液(0.1 mol/L甘氨酸-HCl，pH=3.0)，以1 mL/min的速度經(jīng)過(guò)蛋白A層析柱，以洗脫結(jié)合于蛋白A上的HLA-A2二聚體；每1 mL收集一管，隨時(shí)用pH試紙監(jiān)測(cè)pH值的變化，用Brodford液檢測(cè)每管蛋白質(zhì)含量；在pH值發(fā)生變化的收集樣品中，加入10 μL 1 mol/L Tris堿溶液，將pH值調(diào)至7～8之間；Brodford液檢測(cè)到蛋白含量較高的樣品；以1 mg/mL的BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用Brodford液檢測(cè)收獲的純化蛋白的總蛋白濃度；SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化的HLA-A2二聚體的純度；利用W6/32與抗人IgG1 Fc抗體檢測(cè)構(gòu)象正確的HLA-A2二聚體的濃度。

1.2.6 兩步法離子交換層析技術(shù)純化HLA-A2二聚體 選擇陰離子交換劑纖維素DE-52，將1 mL 7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清加入到含有DE-52的不同EP管中，離心去掉上清，并應(yīng)用pH值5.8～8.0的不同PB緩沖液進(jìn)行重懸，通過(guò)Bradford法與ELISA法聯(lián)合檢測(cè)上清中HLA-A2二聚體及其它蛋白的析出情況，確定HLA-A2二聚體與細(xì)胞培養(yǎng)上清中的大部分蛋白的洗脫條件。

①pH=6.2條件下的離子交換層析：在pH=6.2的條件下，7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清中大部分雜蛋白可結(jié)合在DE-52層析柱上，而HLA-A2二聚體不能結(jié)合。收集300 mL含HLA-A2二聚體的7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清，透析(0.01 mol/L PB，pH=6.2)；將溶脹與堿處理后(0.5 mol/L NaOH)的DE-52纖維素填充層析柱，并用0.01 mol/L PB(pH=6.2)充分平衡；將透析好的7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清(0.01 mol/L PB，pH=6.2)上樣于預(yù)平衡完全的DE52層析柱中，流速控制在1～2 mL/min；收集流出液，利用W6/32與抗人IgG抗體進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測(cè)流入液與流出液中HLA-A2二聚體的含量。

② pH=7.4條件下的離子交換層析：在pH=7.4條件下，HLA-A2二聚體可結(jié)合到DE-52層析柱上。收集第1次離子交換層析的流出液，并用pH7.4的0.01 mol/L PB充分透析；將透析好的第1次離子交換層析的流出液(0.01 mol/L PB，pH=7.4)上樣于用pH7.4 PB預(yù)平衡完全的DE52層析柱中，流速控制在1～2 mL/min；棄去流出液；利用洗脫液(0.5 mol/L NaCl-PB，pH=7.4)進(jìn)行洗脫收集，利用Brodford液檢測(cè)收獲的純化蛋白的總蛋白濃度；SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化的HLA-A2二聚體的純度；利用W6/32與抗人IgG抗體檢測(cè)構(gòu)象正確的HLA-A2二聚體的濃度。

1.2.7 兩種純化方法的效率比較 300 mL的7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清通過(guò)SPA親和層析與兩步法離子交換層析分別進(jìn)行純化，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；回收率計(jì)算公式為：(純化后正確構(gòu)象的HLA-A2二聚體量-純化前HLA-A2/IgG1融合蛋白總量)/(純化前HLA-A2/IgG1融合蛋白總量)×100%；在收集峰管中，HLA-A2二聚體的濃度通過(guò)W6/32與抗人2m進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測(cè)計(jì)算。HLA-A2二聚體的純度計(jì)算公式：(HLA-A2二聚體的濃度)/(Bradford法檢測(cè)的總蛋白濃度)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 7A2D細(xì)胞可高效表達(dá)HLA-A2二聚體

HLAⅠ類(lèi)分子的構(gòu)象依賴(lài)性抗體W6/32可識(shí)別HLAⅠ類(lèi)分子重鏈與輕鏈結(jié)合后在α2-α3區(qū)域形成的構(gòu)象，抗人IgG1抗體可識(shí)別HLA-A2二聚體中IgG1 Fc段。利用W6/32與抗人IgG1抗體對(duì)轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1+[HLA-A2/IgG1]質(zhì)粒的7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有能夠與W6/32和抗人IgG抗體同時(shí)結(jié)合的HLA-A2二聚體(結(jié)果如圖1A)。進(jìn)一步利用抗人IgG抗體對(duì)表達(dá)的HLA-A2/IgG1融合蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，檢測(cè)其分子量以及是否以二聚體形式存在。結(jié)果如圖1B所示，樣品經(jīng)過(guò)β-巰基乙醇的還原處理后進(jìn)行SDS變性聚丙烯凝膠電泳，用抗人IgG Fc抗體均可檢測(cè)到一條70 kD的蛋白質(zhì)條帶，樣品如果不進(jìn)行還原處理而保持二硫鍵的存在，利用抗人IgG Fc抗體則可檢測(cè)到一條大約150 kD大小的片段，說(shuō)明HLA-A2/IgG1融合蛋白在未進(jìn)行還原處理前，是以二聚體的形式存在。為了更準(zhǔn)確地估計(jì)7A2D細(xì)胞表達(dá)的HLA-A2二聚體的量，利用1 mg/mL的HLA-A2作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)W6/32與抗2m抗體進(jìn)行夾心ELISA檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)7A2D上清中HLA-A2二聚體的量，結(jié)果如圖2，通過(guò)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清中HLA-A2二聚體的濃度為4.4 μg/mL。

A：利用HLAⅠ類(lèi)分子的構(gòu)象抗體W6/32作為捕獲抗體，抗人IgG Fc抗體作為檢測(cè)抗體，進(jìn)行夾心ELISA，檢測(cè)得7A2D的細(xì)胞上清的A值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于RPMI 1640組(空白對(duì)照)與未轉(zhuǎn)染的721.221上清的A值；B：利用抗人Fc抗體對(duì)7A2D上清進(jìn)行Western blot鑒定，條帶1為還原型SDS-PAGE電泳，條帶2為非還原型PAGE電泳。圖1 ELISA與Western blot法鑒定7A2D表達(dá)的HLA-A2二聚體Fig.1 Expression of HLA-A2 dimers in 7A2D identified by ELISA and Western blotting

通過(guò)W6/32與抗2m抗體夾心ELISA檢測(cè)的HLA-A2標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)樣品為10倍稀釋的7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的方程以及分子量推算HLA-A2二聚體的濃度為4.4μg/mL。圖2 7A2D可高效表達(dá)HLA-A2二聚體Fig.2 High expression of HLA-A2 dimer in 7A2D

2.2 SPA親和層析純化方法容易導(dǎo)致HLA-A2二聚體變性

由于HLA-A2二聚體含有人IgG1 Fc段，后者與SPA有高親和力結(jié)合的作用，因此可利用SPA親和層析純化HLA-A2二聚體。然而在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，盡管親和層析可有效地純化含F(xiàn)c段的融合蛋白，但pH=3.0的洗脫條件使大部分的HLA-A2二聚體發(fā)生了變性反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過(guò)SPA柱親和層析后收獲的蛋白中，總蛋白的含量相對(duì)較高，而利用構(gòu)象依賴(lài)性抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)出的HLA-A2二聚體的含量很低，HLA-A2二聚體的回收率僅為7%左右。主要原因可能為低pH值導(dǎo)致與HLA-A2重鏈非共價(jià)結(jié)合的2m與抗原肽的解離，并且在純化完后加入2m也無(wú)法促進(jìn)變性的二聚體恢復(fù)構(gòu)象。調(diào)高洗脫液的pH值卻導(dǎo)致蛋白洗脫效率低下，無(wú)法利用親和層析有效地純化HLA-A2二聚體(結(jié)果未顯示)。

圖3 SPA親和層析純化方法導(dǎo)致HLA-A2二聚體變性Fig.3 Denaturation of HLA-A2 dimer by SPA affinity chromatography

2.3 兩步法離子交換層析技術(shù)可有效純化HLA-A2二聚體

相對(duì)于親和層析，離子交換層析法的洗脫條件相對(duì)溫和。

在本研究中，檢測(cè)7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清中蛋白以及HLA-A2二聚體在不同pH值條件下與DE52的結(jié)合情況，結(jié)果顯示在pH=6.2，0.01 mol/L PB的緩沖條件下，7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清中99.2%的蛋白能夠與DE52結(jié)合，而HLA-A2二聚體不結(jié)合；在pH=7.4的條件下，99.6%的HLA-A2二聚體可有效地與DE52結(jié)合(圖4A)。并且結(jié)合在DE52上的二聚體可在NaCl濃度為500 mmol/L的條件下有效洗脫，結(jié)果見(jiàn)圖4B。

A：7A2D細(xì)胞上清中總蛋白與HLA-A2二聚體在pH=6.2與7.4條件下與DE52的結(jié)合效率檢測(cè)；B：利用150、500、2000 mmol/L NaCl對(duì)結(jié)合在DE52層析柱上的HLA-A2二聚體的洗脫效率檢測(cè)，其中500 mol/L NaCl可有效洗脫結(jié)合在層析柱上的HLA-A2二聚體圖4 7A2D培養(yǎng)上清中的HLA-A2二聚體及雜蛋白與DE52的結(jié)合分析Fig.4 Analysis of binding of HLA-A2 dimer and heteroprotein to DE52 in culture supernatant of 7A2D

根據(jù)7A2D細(xì)胞上清中HLA-A2二聚體及其它蛋白與DE52在不同的pH值條件下的結(jié)合能力不同，本研究建立兩步法離子交換層析技術(shù)，包括以下兩步：① pH6.2條件下的離子交換層析，可去除大部分的雜蛋白；②pH7.4條件下的離子交換層析，在該條件下DE52層析柱可結(jié)合大部分的HLA-A2二聚體，并有效地通過(guò)500 mmol/L NaCl-PB洗脫收集。經(jīng)過(guò)兩步法離子交換層析，可有效純化HLA-A2二聚體，并且不引起HLA-A2二聚體變性，結(jié)果見(jiàn)圖5所示。經(jīng)過(guò)兩步離子交換層析后，

利用Bradford法檢測(cè)不同收集管中蛋白的洗脫峰，其中6號(hào)收集管為洗脫峰，經(jīng)過(guò)Bradford法測(cè)定6號(hào)收集管中總蛋白的濃度約338 μg/mL，SDS-PAGE灰度掃描分析顯示其中HLA-A2/IgG1蛋白純度約為69.2%，經(jīng)計(jì)算6號(hào)收集管中含有的HLA-A2/IgG1蛋白約為242 μg/mL。與利用W6/32與抗Fc抗體雙抗夾心ELISA法檢測(cè)的HLA-A2二聚體的含量(234 μg/mL)基本一致，說(shuō)明兩步離子交換層析方法獲得的純化的HLA-A2二聚體保持天然構(gòu)象。

A：利用Bradford法與ELISA法檢測(cè)經(jīng)500 mmol/L NaCl洗脫后不同收集管中含有的總蛋白與HLA-A2二聚體的含量；B：6號(hào)收集管中的樣品還原型SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示HLA-A2/IgG1蛋白純度較高圖5 兩步離子交換層析純化法可使HLA-A2二聚體有效純化并保持天然構(gòu)象Fig.5 Two-step ion exchange chromatography effectively purifies HLA-A2 dimer and maintains its natural conformation

2.4 兩種純化方法的效率比較

結(jié)果見(jiàn)表1，兩步法離子交換層析純化后HLA-A2二聚體含量、HLA-A2二聚體回收率(%)分別為(752±95)μg/mL、(51.9±6.5)%，較親和層析純化后的(106±16)μg/mL、(7.3±1.1)%有較大提升(均P<0.01)；兩步法離子交換層析純化后收集峰中的HLA-A2二聚體純度、含量分別為(72.9±4.6)%、(238.0±26.1)μg/mL，較親和層析純化后的(10.4±1.3)%、(37.0±9.2)μg/mL明顯升高(均P<0.01)。

表1 兩種純化方法從7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清純化HLA-A2二聚體的效率比較Table 1 Comparison of the efficiency of two purification methods for purification of HLA-A2 dimer from 7A2D cell culture supernatant

說(shuō)明兩步離子交換層析法可以獲得高純度、高濃度的HLA-A2二聚體。

與親和層析純化后比較，*P<0.01；a：通過(guò)Bradford法檢測(cè)樣品中含有的總蛋白的量；b：分子量正確的經(jīng)過(guò)變性的HLA-A2/IgG融合蛋白，其含量通過(guò)Bradford法與SDS-PAGE結(jié)合分析；c：利用構(gòu)象依賴(lài)性抗體W6/32與抗人2m進(jìn)行雙抗夾心ELISA分析獲得的具有正確構(gòu)象的HLA-A2二聚體的量

3 討論

真核細(xì)胞表達(dá)的蛋白存在純化困難、產(chǎn)量較低等問(wèn)題，并且7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有眾多雜蛋白。前期功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7A2D細(xì)胞上清中的HLA-A2二聚體在可溶性的狀態(tài)下可抑制同種反應(yīng)的強(qiáng)度與同種反應(yīng)性T細(xì)胞的功能，而當(dāng)上清中的HLA-A2二聚體加載到單核細(xì)胞表面，可人為地控制自身單核細(xì)胞作為單個(gè)同種表位的抗原提呈細(xì)胞，刺激表位特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生[9]。然而沒(méi)有高純度的具有正確構(gòu)象的HLA-A2二聚體，無(wú)法進(jìn)行HLA-A2二聚體功能實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制與定量分析，提供HLA-A2二聚體調(diào)節(jié)特異性T細(xì)胞應(yīng)答的有力證據(jù)與應(yīng)用潛能。

通過(guò)表達(dá)細(xì)胞的篩選我們發(fā)現(xiàn)，人源性721.221細(xì)胞系由于其HLAⅠ類(lèi)分子重鏈表達(dá)缺陷，并且細(xì)胞內(nèi)富含游離的2m[6]，可高效表達(dá)HLA-A2二聚體，其中通過(guò)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并高表達(dá)HLA-A2二聚體的細(xì)胞株，命名為7A2D。該細(xì)胞株在體外連續(xù)傳代50代以上依然保持高表達(dá)新型HLA-A2二聚體的特性，并且凍存后重新復(fù)蘇也不影響二聚體的表達(dá)。7A2D表達(dá)的HLA-A2二聚體含有人IgG1 Fc段，其可與SPA特異性結(jié)合，因此可利用SPA親和層析進(jìn)行純化[10]，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)SPA親合層析純化后回收到的具有正確構(gòu)象和生物學(xué)活性的二聚體卻很少，回收率僅為7%左右；由于HLA-A2二聚體分子中，HLA-A2的α鏈與2m及抗原肽為非共價(jià)結(jié)合，在SPA親和層析純化過(guò)程中經(jīng)酸性條件(pH3.0)洗脫后，2m及抗原肽從重鏈解離，致使大量的HLA-A2二聚體變性失去正確構(gòu)象。我們的ELISA檢測(cè)體系中的包被抗體使用的是W6/32，它是HLA Ⅰ類(lèi)分子表位特異性的單克隆抗體，識(shí)別重鏈與輕鏈結(jié)合后形成的重鏈α2-α3區(qū)特定表位的鼠抗人mAb W6/32，不與單獨(dú)的輕鏈或重鏈結(jié)合。在pH3.0的洗脫環(huán)境中大量的2m與HLA-A2的重鏈形成的非共價(jià)鍵打開(kāi)，從而使2m與抗原肽從復(fù)合物上脫落下來(lái)。故檢測(cè)到的有生物學(xué)活性的HLA-A2二聚體很少。這與文獻(xiàn)報(bào)道的pH3.8時(shí)，結(jié)合在細(xì)胞表面大部分的2m與重鏈解離脫落相吻合[11]。

離子交換層析是通過(guò)不同的蛋白等電點(diǎn)與所帶電荷的差異來(lái)分離蛋白的純化技術(shù)[12-13]，由于7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清中大部分的蛋白的等電點(diǎn)在5.5左右，而HLA-A2的理論等電點(diǎn)約6.5，這種等電點(diǎn)的差異為利用離子交換層析純化HLA-A2二聚體提供了可能。我們的研究顯示，在pH=6.2的條件下，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的大部分蛋白結(jié)合到DE52層析柱上，而HLA-A2二聚體在該條件下帶有正電荷因此無(wú)法結(jié)合到DE-52層析柱上，而在pH=7.4的條件下，99%以上的二聚體結(jié)合到DE52層析柱上，因此通過(guò)pH6.2與pH7.4的兩步法離子交換層析可有效地從7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化HLA-A2二聚體；并且通過(guò)兩步法離子交換層析，300 mL的7A2D細(xì)胞培養(yǎng)上清中可純化獲得濃度大于200 μg/mL，純度大約70%的構(gòu)象完整的HLA-A2二聚體。

綜上所述，本研究通過(guò)HLA-A2二聚體與其它蛋白的等電點(diǎn)可能存在的差異建立了一種純化條件相對(duì)溫和的兩步法離子交換層析純化方法，經(jīng)過(guò)該方法制備獲得的高純度與高濃度的HLA-A2二聚體可保持正確的空間構(gòu)象，達(dá)到了純化與濃縮的目的，為更有效地結(jié)合與檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞提供了有力工具。