楊 麗， 吳雪虎， 郭 曉， 殷彩橋， 張孟賢， 方呈祥△

湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院1腫瘤科2消化內(nèi)科，恩施 4450003華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤中心，武漢 430030

胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)是消化系統(tǒng)腫瘤中惡性程度高、預(yù)后極差的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位居前列，60%患者就診時已因發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而失去根治手術(shù)的機(jī)會，中位生存期僅約15個月[1]。PAAD因其起病隱匿、診斷不及時且治療方法有限而未能改善其惡性進(jìn)展的趨勢。盡管目前治療胰腺癌新藥的臨床試驗不斷開展，但其成效也十分有限。因而，進(jìn)一步探究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的切入點亟待進(jìn)行。

miRNA(microRNA)是一類長度約20～24個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，由內(nèi)源基因編碼，主要參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控[2]。迄今，已有大約2萬多個miRNA被研究發(fā)現(xiàn)，其中大部分miRNA可以通過調(diào)節(jié)人類1/3的基因表達(dá)而參與生命過程復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。越來越多的研究也證實miRNA在多種疾病及惡性腫瘤中表達(dá)異常，發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用，甚至在機(jī)體不同組織、不同發(fā)育階段中扮演著癌基因或抑癌基因的角色[3-4]。miRNA的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，很多領(lǐng)域還處于研究的盲點。目前，越來越多的DNA甲基化和mRNA/miRNA表達(dá)譜被發(fā)表在不同的公共知識庫中，這些數(shù)據(jù)可以幫助研究人員確定表觀遺傳模式，這是研究致癌機(jī)制的重要方向。目前，有關(guān)hsa-miR-194在胰腺癌中的表達(dá)與靶基因預(yù)測及其功能研究尚未見報道。本研究旨在通過多種生物信息分析工具，研究胰腺癌中差異表達(dá)的miRNA，預(yù)測hsa-miR-194可能參與調(diào)控的靶基因，為實現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 利用miRGator v3.0分析hsa-miR-194在不同疾病中的表達(dá)

miRGator v3.0(http：//mirgator.kobic.re.kr/)在線數(shù)據(jù)庫是一個整合了miRNA表達(dá)、靶標(biāo)預(yù)測、基因表達(dá)數(shù)據(jù)、功能分析和疾病相關(guān)信息的功能注釋系統(tǒng)[5]。miRGator集中收錄了包括TCGA、GEO、SRA等數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的70多個人類miRNA測序數(shù)據(jù)[6]。將hsa-miR-194輸入miRGator v3.0數(shù)據(jù)庫，檢索其在不同疾病，包括惡性腫瘤中的表達(dá)情況。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)處理

從TCGA(The Cancer Genome Atlas，https：//cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載有關(guān)胰腺癌的miRNA-seq轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后轉(zhuǎn)換成miRNA命名的矩陣文件。通過R3.5.1軟件(https：//www.r-project.org/)，安裝edgeR等軟件包(https：//bioconductor.org/biocLite.R)，設(shè)P<0.05和差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)的絕對值≥ 2為過濾條件，篩選出胰腺癌與正常組織樣本間顯著表達(dá)差異的miRNAs，并使用R軟件制作熱圖(heatmap)。

1.3 miR-194的堿基序列及保守性分析

miRbase(http：//www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫是目前用于存儲miRNA序列數(shù)據(jù)、注釋、預(yù)測基因靶標(biāo)等信息的全方位公共數(shù)據(jù)庫之一，包含206個物種的30424個成熟的miRNA序列，研究者可通過miRNA的名字、ID、染色體位置、序列進(jìn)行檢索[7]。使用miRbase檢索獲得有關(guān)hsa-miR-194的染色體定位、堿基序列以及物種保守性的信息。

1.4 hsa-miR-194在胰腺癌中的DNA甲基化水平

MethHC(http：//MethHC.mbc.nctu.edu.tw)數(shù)據(jù)庫整合了TCGA數(shù)據(jù)庫中包含的18種癌癥、6000多個樣本相關(guān)的DNA甲基化、miRNA基因DNA甲基化、mRNA和miRNA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)[8]?；贛ethHC數(shù)據(jù)庫分析hsa-miR-194在胰腺癌中的DNA甲基化水平較正常組織的差異。

1.5 hsa-miR-194靶基因預(yù)測

TargetScan v7.0(http：//www.targetscan.org/)提供了包括人、鼠等多類物種的信息，通過搜索和每條miRNA種子區(qū)域匹配的保守的8 mer和7 mer位點來預(yù)測靶基因[9]。DIANA-microT-CDS[10](http：//diana.imis.athena-innovation.gr/)和miRanda(http：//www.microrna.org/)數(shù)據(jù)庫也收錄了有關(guān)人類、鼠、魚、斑馬等物種基因組的miRNA靶標(biāo)預(yù)測信息以及miRNA在不同組織及疾病中的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。miRTarBase數(shù)據(jù)庫收錄了經(jīng)實驗驗證的miRNA靶標(biāo)，同時提供了支持搜索結(jié)果的文獻(xiàn)[11]。通過TargetScan v7.0、DIANA-microT-CDS和miRanda這3種miRNA靶基因預(yù)測工具，獲取hsa-miR-194的公共靶基因，并通過miRTarBase(http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗證。

1.6 hsa-miR-194靶基因GO功能注釋和KEGG富集分析

使用DAVID 6.8網(wǎng)絡(luò)在線分析數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)對hsa-miR-194的靶基因進(jìn)行GO(gene ontology)功能注釋，其內(nèi)容包括了基因參與的生物學(xué)過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)以及細(xì)胞組成(cellular component，CC)。同時，對靶基因進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，找出差異顯著的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及腫瘤相關(guān)信號通路。設(shè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa-miR-194的表達(dá)情況

根據(jù)miRGator v3.0數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-194在結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、腎透明細(xì)胞癌等惡性腫瘤中的表達(dá)豐度顯著升高(P<0.05，圖1)。miRGator收錄的相關(guān)疾病信息中沒有包含胰腺癌的數(shù)據(jù)，因而有關(guān)其在胰腺癌中的表達(dá)研究尚未見明確報道。我們基于目前使用最廣、最具權(quán)威的TCGA癌癥數(shù)據(jù)庫單獨下載有關(guān)胰腺癌的miRNA-seq轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，其中包含了179個胰腺癌組織樣本和4個正常組織樣本。根據(jù)篩選條件得到差異表達(dá)的miRNA列表共15個，其中含2個顯著表達(dá)上調(diào)的miRNA，分別是hsa-miR-194-2、hsa-miR-194-1，以及13個表達(dá)下調(diào)的miRNA(圖2)。miR-194在人類組織的成熟序列為hsa-miR-194-5p，hsa-miR-194-1與hsa-miR-194-2均是has-miRNA-194-5p/hsa-miRNA-194-3p的前體結(jié)構(gòu)(二級結(jié)構(gòu))，即為miRNA-194的stem-loop。因而，我們選擇miR-194進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 hsa-miR-194在不同疾病中的表達(dá)豐度Fig.1 The expression abundance of hsa-miR-194 in different diseases

圖2 胰腺癌中差異表達(dá)的miRNA熱圖Fig.2 Heatmap of the differentially expressed miRNA in PAAD tissues

2.2 miRNA-194的保守性

利用miRbase檢索發(fā)現(xiàn)hsa-miR-194定位于染色體11q13.1，同時通過分析包括人類在內(nèi)的9個物種的miR-194成熟序列(mature sequence)發(fā)現(xiàn)，miR-194的22個堿基序列“UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA”趨于穩(wěn)定，且在多物種中高度保守(表1)。

表1 不同物種的miRNA-194堿基序列Table 1 Sequences of miR-194 in different species

2.3 hsa-miR-194在PAAD中的DNA甲基化水平

甲基化作用是轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)調(diào)控的重要方式，DNA甲基化異常可干擾基因的正常轉(zhuǎn)錄過程。通過MethHC數(shù)據(jù)庫研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-194在PAAD組織與正常胰腺組織中的DNA啟動子區(qū)甲基化水平具有顯著差異。與正常胰腺組織比較，PAAD組織中hsa-miR-194的表達(dá)豐度上調(diào)，但其甲基化水平降低(P<0.01，圖3)。

與正常胰腺組織比較，**P<0.01圖3 hsa-miR-194在PAAD組織和正常胰腺組織中的DNA甲基化水平Fig.3 DNA methylation levels of hsa-miR-194 in PAAD tissues and normal pancreas tissues

2.4 hsa-miR-194的靶基因預(yù)測

通過TargetScan、miRanda、DIANA-microT-CDS預(yù)測hsa-miR-194的靶基因數(shù)分別為473、676和860個，三者取交集；進(jìn)而在miRTarBase數(shù)據(jù)庫中檢索到具有高證據(jù)級別證實的靶基因共24個。將以上兩者結(jié)合分析后發(fā)現(xiàn)，由實驗方法確認(rèn)和文獻(xiàn)可檢索到的最終候選靶標(biāo)共15個(表2)。

表2 The target genes of has-miR-194Table 2 hsa-miRNA-194的靶基因

2.5 hsa-miR-194靶基因GO注釋和KEGG富集分析

GO功能注釋顯示，hsa-miR-194靶基因所富集的功能主要表現(xiàn)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)(regulation of signal transduction)、細(xì)胞粘附(cell adhesion)、蛋白結(jié)合(protein binding)、胚期后發(fā)育(post-embryonic development)、正向調(diào)控蛋白激酶B信號(positive regulation of protein kinase B signaling)等；基于KEGG的通路富集分析顯示hsa-mir-194靶基因主要參與了細(xì)胞周期調(diào)控(cell cycle)JAK-STAT信號通路(JAK-STAT signaling pathway)、TGF-beta信號通路(TGF-beta signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、Ras信號通路(Ras signaling pathway)、Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)以及PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)等，同時還參與了乳腺癌(breast cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、結(jié)直腸癌(colorectal cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、肝癌(hepatocellular carcinoma)等癌癥相關(guān)信號通路的轉(zhuǎn)錄失調(diào)。見表3。

表3 hsa-miR-194靶基因的GO注釋和KEGG富集分析Table 3 GO and KEGG enrichment analysis of hsa-miR-194 target genes

3 討論

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫整理分析了胰腺癌中miRNA的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa-miR-194在胰腺癌中的表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步，我們通過miRGator數(shù)據(jù)庫檢索到hsa-miR-194在結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、腎透明細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中的表達(dá)豐度也顯著升高。因而，我們推測hsa-miR-194可能參與了胰腺癌發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控機(jī)制。miRNA高度的保守性與其功能的重要性有著密切的關(guān)系。我們基于miRbase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),miR-194在包括人在內(nèi)的9個物種中其成熟堿基序列高度保守，表明其在調(diào)控生命活動過程中的穩(wěn)定性，miR-194參與編碼的蛋白質(zhì)也有著極其重要的作用。DNA甲基化是基因轉(zhuǎn)錄的重要表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子，啟動子區(qū)DNA甲基化水平高的基因在轉(zhuǎn)錄上是沉默的，但在正常細(xì)胞中如果一些基因和重復(fù)序列的甲基化水平降低，也將出現(xiàn)基因表達(dá)和重復(fù)序列的激活，從而導(dǎo)致基因印記丟失，X染色體失活，細(xì)胞過度增長，表觀遺傳學(xué)的改變等，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常胰腺組織比較，PAAD組織中hsa-miR-194的DNA甲基化水平降低。DNA甲基化水平可能并非影響hsa-miR-194在PAAD中表達(dá)豐度的決定因素，可能還存在著其他調(diào)控機(jī)制。DNA甲基化水平失衡干擾了基因的正常轉(zhuǎn)錄過程，可引起癌基因的擴(kuò)增、抑癌基因的失活。因而，在腫瘤治療過程中，可以考慮通過調(diào)節(jié)DNA甲基化位點，保持基因甲基化平衡，調(diào)控基因的正常轉(zhuǎn)錄。

miRNA參與的生命活動包括了生長發(fā)育，細(xì)胞增殖、遷移與凋亡，器官形成，脂肪代謝以及細(xì)胞分化等，其具體的作用機(jī)制十分復(fù)雜。通常，一個miRNA可以通過調(diào)控多個靶基因的表達(dá)，也可以通過多個miRNA相互結(jié)合而精準(zhǔn)調(diào)控某個基因的表達(dá)。為了明確hsa-miR-194如何在胰腺癌等惡性腫瘤中發(fā)揮作用，需要預(yù)測其相互作用的靶基因，研究靶基因的功能。目前，用于miRNA靶基因預(yù)測的常用數(shù)據(jù)庫較多，我們選取了TargetScan、miRanda和DIANA-microT-CDS三大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測，取三者的交集后通過miRTarBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗證，最后得到RAC1、CDH2、IGF1R、HBEGF、SOCS2、SOX5和RBX1等15個候選靶標(biāo)。這些靶基因與hsa-miR-194的相互作用均經(jīng)過了Western blot、qPCR等實驗方法驗證，且有相關(guān)文獻(xiàn)報道，有著較高的證據(jù)級別。Miao等[12]研究報道m(xù)iR-194通過靶向CDH2抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)miR-194靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號抑制因子2(suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2)導(dǎo)致致癌激酶FLT3和JAK2的表達(dá)降低，所引起的ERK和STAT3信號通路增強(qiáng)可以通過Wnt信號通路靶向調(diào)節(jié)泛素連接酶TRAF6的表達(dá)，增強(qiáng)直腸癌患者新輔助治療的敏感性，從而作為局部進(jìn)展期直腸腺癌患者新輔助放化療反應(yīng)敏感性的預(yù)測生物標(biāo)志[13]。Das等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-194是前列腺癌轉(zhuǎn)移的一個驅(qū)動因素，通過靶向SOCS2導(dǎo)致致癌激酶FLT3和JAK2的表達(dá)降低，活化ERK和STAT3信號通路，從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal translation，EMT)。靶基因參與調(diào)控的機(jī)制也錯綜復(fù)雜，因而我們進(jìn)一步通過生物信息分析技術(shù)對靶基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-194靶基因所富集的功能主要在于細(xì)胞粘附、蛋白結(jié)合、胚期后發(fā)育、蛋白激酶B信號正向調(diào)控等；其參與的信號通路主要包括細(xì)胞周期調(diào)控、JAK-STAT、TGF-beta、MAPK、Ras以及Wnt等信號通路，同時還參與了乳腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、肝癌、腎癌等惡性腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄失調(diào)。Yang等[15]研究報道，miR-194在乳腺癌中表達(dá)升高，下調(diào)miR-194的表達(dá)可以促進(jìn)SOX家族轉(zhuǎn)錄因子17的表達(dá)，調(diào)控Wnt/-catenin信號通路，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Bai等[16]研究報道，miR-194可通過PI3K/AKT/FoxO3a和p53/p21信號通路抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加Caspase-3/-9活性，促進(jìn)人黑色素瘤細(xì)胞Bax/Bcl-2的表達(dá)。has-miR-194可以在不同惡性腫瘤中扮演癌基因或抑癌基因的角色而發(fā)揮不同的作用，成為腫瘤預(yù)防及治療的潛在靶點。

靶基因RAC1編碼的蛋白是一種GTPase，屬于小GTP結(jié)合蛋白的ras超家族成員，也是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在人體各組織中廣泛表達(dá)，主要參與細(xì)胞有絲分裂周期的調(diào)控、細(xì)胞骨架重排等。有研究報道RAC1在乳腺癌等多種癌癥中過表達(dá)，且其編碼的蛋白不僅可以調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial，VEC)骨架形成，促進(jìn)腫瘤血管生成，還可以影響細(xì)胞粘附與趨化功能，加速缺氧誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[17]。RAC1可以通過調(diào)節(jié)NOXs-ROS-NFκB信號通路激活基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)，誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，影響腫瘤的形成[18]；RAC1還可通過下游分子Pak1激活Lim激酶，影響肌動蛋白的磷酸化而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。RAC1表達(dá)異常，也可以引起多種非腫瘤性的疾病，如亨廷頓舞蹈病、糖尿病視網(wǎng)膜性病變、神經(jīng)退行性疾病、心肌缺血后再灌注損傷等[19-22]。目前，有關(guān)hsa-miR-194如何調(diào)節(jié)RAC1影響胰腺癌進(jìn)展的報道暫未發(fā)現(xiàn)。本研究基于生物信息分析學(xué)發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中hsa-miR-194靶向調(diào)節(jié)RAC1基因，通過K-Ras/PI3K-Akt/NFκB信號通路促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制凋亡，同時還參與調(diào)控細(xì)胞骨架重組和蛋白激酶的激活。這為胰腺癌的基礎(chǔ)研究和靶向治療提供了新的思路。

綜上，miRNA與其靶基因有著密切的聯(lián)系，應(yīng)用生物信息學(xué)篩選腫瘤中異常表達(dá)的miRNA，預(yù)測靶基因并對其進(jìn)行功能富集分析，有助于快速了解miRNA與其靶基因間錯綜復(fù)雜的作用關(guān)系。后期，我們將進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測胰腺癌細(xì)胞miR-194的表達(dá)，并通過Transwell侵襲和遷移實驗檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力等，還將通過雙熒光素酶活性實驗預(yù)測靶基因的作用位點，以期獲得更可靠的實驗結(jié)果，為胰腺癌的治療提供可靠的理論依據(jù)。