姜 洋，劉岳鵬，何學(xué)明，談 笑

1)蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港市東方醫(yī)院皮膚科 江蘇連云港 222042 2)蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港市東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 江蘇連云港 222042 3)蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港市東方醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科 江蘇連云港 222042

長(zhǎng)期、難以抑制的慢性瘙癢困擾了許多患者，并極大降低了患者的生活質(zhì)量，甚至造成心理障礙[1]。目前為止，慢性瘙癢的研究[2]發(fā)現(xiàn)了兩類主要的瘙癢介質(zhì)及其神經(jīng)信號(hào)通路(組胺信號(hào)通路和非組胺信號(hào)通路),且發(fā)現(xiàn)脊髓部位信號(hào)通路的變化對(duì)于慢性瘙癢的發(fā)生可能具有重要作用。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，脊髓和神經(jīng)節(jié)mTOR及其信號(hào)通路被證實(shí)參與多種病理生理過(guò)程的調(diào)節(jié)，比如脊髓再生[3]、 周圍神經(jīng)再生[4]、神經(jīng)病理性痛覺(jué)過(guò)敏[5]、嗎啡耐受[6]等。有實(shí)驗(yàn)[7-9]證實(shí)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白-1(Gli1)是mTOR/核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)信號(hào)通路的下游蛋白；mTOR-S6K1-Gli1信號(hào)通路參與體內(nèi)多個(gè)生理病理過(guò)程，特別是慢性疼痛?？紤]到慢性瘙癢與慢性疼痛在神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中以及機(jī)制方面存在諸多相似性,本研究觀察了慢性瘙癢模型小鼠皮膚及脊髓組織mTOR-S6K1-Gli1信號(hào)通路蛋白的變化，以探討該信號(hào)通路是否參與慢性瘙癢的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1材料雄性2月齡昆明小鼠，體重23～26 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。惡唑酮(美國(guó)Sigma公司)，Gli1抑制劑GANT61 (美國(guó)Selleck公司)，兔抗mTOR抗體、GAPDH單抗(美國(guó)CST公司)，兔抗S6K1抗體、兔抗Gli1抗體(英國(guó)Abcam 公司)，鼠抗兔抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司)，DAB顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，ECL檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。Tanon-5200化學(xué)發(fā)光儀(上海天能公司)，冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.2動(dòng)物分組將40只小鼠分為5組：空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、致癢組、致癢+抑制劑組和致癢+抑制劑溶劑組，每組8只。 動(dòng)物模型的制備參照文獻(xiàn)[10-11]介紹方法,將給藥位置調(diào)整為小鼠腰背部。實(shí)驗(yàn)前2 d,小鼠腰背部備皮,以雙側(cè)髂嵴連線中點(diǎn)為中心，直徑2 cm。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天記為第0 天，上午10點(diǎn)致癢組、致癢+抑制劑組及致癢+抑制劑溶劑組小鼠在備皮中心位置一次性涂抹16 g/L 惡唑酮溶液(乙醇為溶劑)15 μL致敏，空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組分別涂抹15 μL生理鹽水和乙醇；第7、 9、12、14、16、19天上午10點(diǎn),致癢組小鼠涂抹15 μL 8 g/L惡唑酮溶液進(jìn)行激發(fā)，空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組小鼠分別給予15 μL的生理鹽水、乙醇涂抹，致癢+抑制劑組、致癢+抑制劑溶劑組小鼠同致癢組激發(fā)外，致癢+抑制劑組在第14、15、16天上午9 點(diǎn)給予5 μL 40 g/L的GANT61溶液(以體積比為4∶1的玉米油和乙醇為溶劑)鞘內(nèi)注射，致癢+抑制劑溶劑組則給予等體積抑制劑溶劑。

1.3行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)第0、7、9、12、14、16、19 天，局部涂藥前先將小鼠放入15 cm×15 cm×15 cm的透明塑料盒中適應(yīng)30 min取出涂藥后放回盒中觀察,不管小鼠連續(xù)舔或搔抓瘙癢部位多長(zhǎng)時(shí)間均記為一次完整的搔抓動(dòng)作,記錄30 min內(nèi)完成的舔或搔抓次數(shù)。

1.4皮膚組織病理學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)第19天,每組取3只小鼠，行七氟烷吸入麻醉后處死，取給藥處皮膚組織,40 g/L甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，鏡下觀察。

1.5脊髓組織Gli1蛋白表達(dá)的檢測(cè)取1.4中小鼠脊髓腰膨大節(jié)段,加入裂解液,冰浴超聲勻漿，15 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液。蛋白樣品與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按4∶1混合，沸水中加熱10 min。每個(gè)泳道加20 μg蛋白樣品，SDS-PAGE后轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉60 min,加入按1∶2 000稀釋的兔抗Gli1抗體,4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜后再加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔抗體室溫孵育2 h。ECL法顯色，應(yīng)用Image J軟件分析，以目的蛋白條帶和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量,最終結(jié)果均與空白對(duì)照組相比。

1.6脊髓組織mTOR、S6K1和Gli1蛋白表達(dá)的定位取溶劑對(duì)照組和致癢組小鼠各3只,行七氟烷吸入麻醉，給予40 g/L多聚甲醛心臟灌注，取脊髓腰膨大節(jié)段，置于40 g/L多聚甲醛中固定過(guò)夜，脫水后連續(xù)切片(厚度15 μm)。體積分?jǐn)?shù)3%H2O2孵育10 min，分別加入按1∶100稀釋的兔抗mTOR、S6K1和Gli1抗體,4 ℃過(guò)夜，加相應(yīng)二抗室溫孵育2 h,DAB顯色、封片。顯微鏡采集圖像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。5組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)搔抓次數(shù)的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,各組小鼠脊髓組織中Gli1蛋白表達(dá)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)， 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.15組小鼠搔抓次數(shù)的比較與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組比較，致癢組小鼠搔抓次數(shù)逐漸增加，并在第16天達(dá)高峰。致癢組與致癢+抑制劑組小鼠搔抓次數(shù)在第0～12天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在第14、16、19天，致癢+抑制劑組小鼠搔抓次數(shù)少于致癢組(表1)。

2.25組小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)第19天,空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組小鼠皮膚組織未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或皮膚改變；致癢組小鼠皮膚表皮組織可見(jiàn)細(xì)胞水腫,真皮及皮下組織尤其毛囊周圍可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞、少許嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)合表1結(jié)果，說(shuō)明瘙癢模型成功建立。與致癢組比較，致癢+抑制劑組小鼠皮膚組織炎癥細(xì)胞減少(圖1)。

表1 5組小鼠搔抓次數(shù)的比較(n=8)

A、B、C、D、E：分別為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、致癢組、致癢+抑制劑組和致癢+抑制劑溶劑組

2.35組小鼠脊髓組織中Gli1蛋白的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)第19天，各組小鼠脊髓組織中Gli1蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=128.902,P<0.001)；與溶劑對(duì)照組(1.034±0.039)相比，致癢組(2.519±0.096)和致癢+抑制劑溶劑組(2.302±0.077) Gli1蛋白的表達(dá)升高(P<0.05)，而致癢+抑制劑組(1.132 ±0.069)無(wú)明顯變化(P>0.05)。

圖2 各組小鼠脊髓組織中Gli1蛋白的表達(dá)

2.4溶劑對(duì)照組和致癢組小鼠脊髓組織mTOR、S6K1、Gli1蛋白的定位結(jié)果見(jiàn)圖3。mTOR、S6K1、Gli1主要表達(dá)在致癢組小鼠脊髓背角淺層。

1：mTOR；2：S6K1；3：Gli1

3 討論

本研究參照文獻(xiàn)[10-11]建立小鼠慢性瘙癢模型，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組比較，致癢組小鼠搔抓次數(shù)增加，結(jié)合實(shí)驗(yàn)第19天,致癢組小鼠皮膚表皮組織細(xì)胞水腫,真皮及皮下組織尤其毛囊周圍可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞及少許嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),說(shuō)明模型建立成功。

研究[2]表明，慢性瘙癢有兩條神經(jīng)信號(hào)通路：組胺信號(hào)通路和非組胺信號(hào)通路，且提示脊髓部位信號(hào)通路的變化與慢性瘙癢的發(fā)生有關(guān)。有研究[12]表明背根神經(jīng)節(jié)部位的mTOR參與小鼠的慢性瘙癢過(guò)程。另外，有臨床試驗(yàn)[13]表明mTOR抑制劑可以顯著緩解骨髓纖維化患者的瘙癢癥狀，亦印證了mTOR相關(guān)信號(hào)通路與慢性瘙癢有關(guān)。此外，研究[14]表明慢性疼痛與慢性瘙癢有許多相似點(diǎn)并且共享相同的信號(hào)通路，比如二者都是由背根神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元所傳導(dǎo)；瞬時(shí)受體電位離子通道亞型V1和A1、Toll樣受體和蛋白酶激活受體既參與介導(dǎo)疼痛也參與介導(dǎo)瘙癢。已有研究[9，15]表明mTOR-S6K1-Gli1參與慢性疼痛的發(fā)生和發(fā)展，因此推測(cè)該信號(hào)通路可能在慢性瘙癢過(guò)程中有一定的作用。mTOR-S6K1-Gli1信號(hào)通路被稱作非經(jīng)典的Hh信號(hào)通路。研究[16]表明Hh信號(hào)可以活化mTOR蛋白，進(jìn)而影響下游的Gli1信號(hào)的穩(wěn)定性。由于mTOR-S6K1-Gli1信號(hào)通路中其他因子在文獻(xiàn)[12]中已有報(bào)道，該研究重點(diǎn)觀察了Gli1在慢性瘙癢發(fā)生過(guò)程中的作用。結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，致癢組小鼠脊髓組織Gli1蛋白的表達(dá)增加，而在瘙癢高峰期(第14、16、19天)給予Gli1蛋白的特異性抑制劑GANT61鞘內(nèi)注射后，小鼠搔抓次數(shù)減少，說(shuō)明Gli1可能參與瘙癢的發(fā)生。

此外，免疫組化結(jié)果顯示mTOR、S6K1和Gli1蛋白在致癢組小鼠脊髓背角淺層表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度高于溶劑對(duì)照組，提示三者可能共同參與慢性瘙癢的發(fā)生。

與文獻(xiàn)[11]結(jié)果相比，本研究中慢性瘙癢模型小鼠的行為學(xué)變化趨勢(shì)有所不同，推測(cè)是改變涂藥部位和(或)皮膚對(duì)藥物的敏感性不同導(dǎo)致小鼠搔抓行為的差異；另外，由于本實(shí)驗(yàn)所用惡唑酮的溶劑為乙醇，而文獻(xiàn)所用溶劑為丙酮，丙酮本身對(duì)皮膚有較強(qiáng)的刺激作用，而乙醇相對(duì)溫和，因此不排除溶劑差異引起瘙癢行為差異的可能。另外，本研究的不足之處：觀察時(shí)間點(diǎn)的設(shè)計(jì)不夠嚴(yán)謹(jǐn)，由于建立瘙癢動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)的觀察間隔常規(guī)取2或3 d,所以本研究未選取相同的時(shí)間間隔；另外，未進(jìn)一步觀察慢性瘙癢過(guò)程中mTOR、S6K1和Gli1的變化，后續(xù)研究中將加以改進(jìn)。

綜上所述，脊髓部位Hh非經(jīng)典通路mTOR-S6K1-Gli1可能參與了慢性瘙癢的發(fā)生。