王 堯，巴宏軍，柳子川，周 旻

1)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)科 廣州 510095 2)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管兒科 廣州 510080

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近幾十年來全球的發(fā)病率明顯增加[1]。雖然整體治療效果較好，但仍有10%的患者預(yù)后極差，包括未分化、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌[2]。近年來，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在多種腫瘤中取得了持久性療效[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤免疫細(xì)胞(tumor-infiltrating immune cells, TIICs)的數(shù)量和分布可影響腫瘤患者的治療反應(yīng)，TIICs成為進(jìn)一步提高患者生存率的潛在藥物靶標(biāo)。甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展與炎癥和免疫細(xì)胞浸潤高度相關(guān)，探索其免疫浸潤模式有助于判斷患者的預(yù)后和治療反應(yīng)[5]。CIBERSORT分析工具能夠利用標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)數(shù)據(jù)估算不同腫瘤樣本中的細(xì)胞組成，具有分辨率高及可同時(shí)量化多種類型免疫細(xì)胞的優(yōu)勢，其優(yōu)越性能已在多種惡性腫瘤中得以驗(yàn)證[6]。本研究中，我們使用CIBERSORT分析甲狀腺癌組織中TIICs的組成，并進(jìn)一步探討其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)采集從癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)下載58例正常甲狀腺和448例甲狀腺癌患者的臨床資料。資料采集時(shí)間(即隨訪截止時(shí)間)為2019年8月31日。正常甲狀腺組織58例,男19例，女39例；年齡36～90(69.1±15.8)歲。甲狀腺癌組織448例，男117例，女331例；年齡34～86(67.3±14.7)歲；TNM分期Ⅰ期258例，Ⅱ期47例，Ⅲ期97例，Ⅳ期46例。

1.2正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中TIICs組成的CIBERSORT評估采用CIBERSORT分析工具(https://cibersort.stanford.edu)推算正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中22種免疫細(xì)胞的組成?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)集使用標(biāo)準(zhǔn)注釋文件編寫，然后上傳到CIBERSORT網(wǎng)站，利用白細(xì)胞特征矩陣(LM22)進(jìn)行1 000次計(jì)算，使用蒙特卡羅抽樣為每個(gè)樣本的反褶積計(jì)算P值。

1.3免疫浸潤模式的聚類分析為了分析甲狀腺癌組織中免疫細(xì)胞比例與患者預(yù)后之間的關(guān)系，對所有樣本進(jìn)行分層和聚類，以確定是否可以根據(jù)22種TIICs來識別免疫細(xì)胞浸潤模式。采用Ward方法對所有樣本數(shù)據(jù)按照免疫細(xì)胞組成比例的不同進(jìn)行聚類。將22種免疫細(xì)胞的比例調(diào)整為0～1之間，采用Elbow法和Gap統(tǒng)計(jì)量相結(jié)合的方法，分析數(shù)據(jù)中不同聚類的可能數(shù)量，通過K-means聚類法選取最佳的聚類中心(k=2)并將樣本分為兩組。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用R軟件(3.5.2版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中TIICs比例的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；不同TNM分期甲狀腺癌組織中TIICs比例的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)?？偵嫫?overall survival, OS)定義為自確診開始至任何原因引起死亡的時(shí)間間隔，通過Kaplan-Meier曲線分析TIICs與OS之間的關(guān)系，并采用log-rank法進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中TIICs的組成與比較結(jié)果見圖1。正常甲狀腺組織中含有豐富的未活化的記憶性CD4+T細(xì)胞[(23.10±2.30)%]、CD8+T細(xì)胞[(17.50±1.80)%]、M0巨噬細(xì)胞[(16.50±1.20)%]；活化的記憶性CD4+T細(xì)胞[(0.32±0.04)%]、活化的樹突狀細(xì)胞[(0.17±0.02)%]及中性粒細(xì)胞[(0.08±0.01)%]比例較低。甲狀腺癌組織中含有豐富的M0巨噬細(xì)胞[(19.50±2.10)%]、未活化的記憶性CD4+T細(xì)胞[(14.20±1.30)%]、CD8+T細(xì)胞[(11.20±1.40)%]和M2巨噬細(xì)胞[(10.80±1.70)%]；活化的肥大細(xì)胞[(0.05±0.01)%]、中性粒細(xì)胞[(0.03±0.01)%]和嗜酸性粒細(xì)胞[(0.02±0.01)%]的比例較低；未發(fā)現(xiàn)幼稚CD4+T細(xì)胞。與正常甲狀腺組織比較，甲狀腺癌組織中M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、未活化的樹突狀細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞的比例較高，而CD8+T細(xì)胞、幼稚B細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞的比例較低(圖2)。

圖1 正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中22種TIICs的組成分布

圖2 正常甲狀腺與甲狀腺癌組織中TIICs組成的差異

2.2甲狀腺癌組織中TIICs與患者預(yù)后的關(guān)系甲狀腺患者低比例的活化的肥大細(xì)胞(χ2=5.471，P=0.021)、中性粒細(xì)胞(χ2=6.724，P=0.016)及高比例的CD8+T細(xì)胞(χ2=7.133，P=0.015)與較長的OS有關(guān)(圖3)。

圖3 甲狀腺癌組織中TIICs與患者預(yù)后的關(guān)系

隨著腫瘤分期的增加，活化的樹突狀細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞比例逐漸增加，而CD8+T細(xì)胞比例逐漸下降(表1)。其他類型的TIICs比例與患者預(yù)后及腫瘤分期無關(guān)。

表1 不同TNM分期甲狀腺癌組織中活化的樹突狀細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比例的比較%

2.3免疫狀態(tài)與甲狀腺癌預(yù)后的關(guān)系通過聚類分析將甲狀腺癌患者分為高免疫組(176例)和低免疫組(272例)，兩組中TIICs的分布情況見圖4A，Kaplan-Meier生存曲線見圖4B，高免疫組預(yù)后優(yōu)于低免疫組(χ2=3.653，P=0.039)。

A：兩組患者TIICs組成的分布；B：兩組患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程受宿主免疫系統(tǒng)的影響，在不同患者、腫瘤不同階段或不同類型腫瘤之間TIICs分布均顯著不同，通過對TIICs的數(shù)量、表型及空間分布進(jìn)行評估可以為患者提供更加可靠的治療策略[7]。本研究通過分析TCGA的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，明確TIICs在甲狀腺癌組織中的分布情況，并進(jìn)一步分析TIICs與預(yù)后的關(guān)系。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages, TAMs)在不同病理亞型的甲狀腺癌組織中有明顯差異，高表達(dá)的TAMs與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤負(fù)荷和不良生存密切相關(guān)[8]。TAMs可通過分泌IL-8提高甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲性[9]。本研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌組織中M0和M2巨噬細(xì)胞相對于正常組織明顯升高，提示它們在甲狀腺癌的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)M0巨噬細(xì)胞的比例隨著腫瘤分期而增加，這反映了腫瘤發(fā)展過程中TIICs亞群的功能異質(zhì)性，并提示M0巨噬細(xì)胞在甲狀腺癌的發(fā)展中具有重要作用，其有可能成為潛在的治療靶點(diǎn)。

鑒于腫瘤免疫特性而提出的“免疫評分”已成為判斷腫瘤預(yù)后的新方法，主要基于對T細(xì)胞亞群尤其是CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的評估[10]。既往研究[11]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織中CD8+T和CD4+T細(xì)胞以及B細(xì)胞與縮小的腫瘤體積具有相關(guān)性，而腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞。本研究中發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌組織中存在豐富的CD8+T細(xì)胞，但相對于正常組織卻明顯降低，高水平的CD8+T細(xì)胞與延長的OS密切相關(guān)，并且隨腫瘤分期的增加CD8+T細(xì)胞比例逐漸下降。因此，我們認(rèn)為CD8+T細(xì)胞對甲狀腺具有保護(hù)作用，是判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

肥大細(xì)胞衍生介質(zhì)如趨化因子CXCL1、CXCL10和CXCL8等能夠促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，在甲狀腺癌組織中CXCL1和CXCL10能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，CXCL8可誘導(dǎo)腫瘤的干細(xì)胞特性或增強(qiáng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。本研究發(fā)現(xiàn)低水平的活化的肥大細(xì)胞與延長的OS具有相關(guān)性。因此靶向肥大細(xì)胞或抑制細(xì)胞因子和趨化因子的治療有可能成為難治性甲狀腺癌的新方法。

綜上所述，本研究揭示了TIICs在甲狀腺癌與正常組織間的分布差異及其在判斷患者預(yù)后中的作用。TIICs在不同分期的甲狀腺癌組織中組成的多樣性表明免疫系統(tǒng)在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著復(fù)雜的作用。本研究將為臨床醫(yī)師在早期判斷預(yù)后及進(jìn)一步制訂個(gè)體化的免疫治療方案提供幫助。