費 晶，鞏 平

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 新疆石河子 832000

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，多種因素導(dǎo)致胃癌的發(fā)生和發(fā)展，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜[1]。據(jù)報道[2]，我國胃癌的療效在一定程度上有所改善，但由于缺乏特定癥狀，早期胃癌診斷困難。胃切除術(shù)聯(lián)合放療廣泛用于胃癌的治療，然而晚期胃癌患者的預(yù)后并不理想?；蛑委熢谀[瘤治療中越來越受到重視，許多癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)可能影響腫瘤細(xì)胞凋亡、放射敏感性和患者預(yù)后[3]。因此，已經(jīng)提出了腫瘤基因治療和放射治療聯(lián)合的治療手段。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]是一種修復(fù)DNA鏈斷裂的基因，參與維持基因組的完整性[4]。研究[5]表明，腫瘤細(xì)胞經(jīng)X射線照射后PARP-1的表達(dá)迅速升高，可修復(fù)DNA損傷進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。已有報道[6-8]發(fā)現(xiàn)沉默PARP-1基因可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞等的放射敏感性。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，PARP-1在胃癌組織中亦呈高表達(dá)。本研究觀察了干擾PARP-1的表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響，以期為胃癌的基因治療提供可能的作用靶點。

1 材料與方法

1.1材料人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及人胃癌細(xì)胞MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27均購自美國ATCC細(xì)胞庫。PARP-1抗體、GAPDH抗體、Caspase-3抗體、Caspase-8抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國CST公司，CCK-8檢測試劑盒購自日本Dojindo公司，Annexin-Ⅴ/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司，特異性PARP-1 siRNA和非特異性siRNA(si-NC)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒購自美國Promega公司，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)GES-1、MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27細(xì)胞均在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)各細(xì)胞生長狀態(tài)及時更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至匯合度達(dá)80%以上時，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3不同細(xì)胞PARP-1mRNA表達(dá)的檢測采用Trizol法分別提取GES-1、MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27細(xì)胞的總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。PARP-1引物序列：上游5’-AAGGCGAATGCCAGCGTTAC-3’，下游5’-GGCACTCTTGGAGACCATGTCA-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游5’-AUAAUUUCAUGAAGUGCUCTT-3’。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)熒光定量PCR檢測試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參。20 μL反應(yīng)體系：cDNA模板0.8 μL，上、下游引物(0.2 μmol/L)各0.8 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，ddH2O 7.6 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算PARP-1 mRNA的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.4HGC-27細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組取HGC-27細(xì)胞接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁生長，匯合度達(dá)50%時分為3組，si-PARP-1組和陰性對照組采用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染特異性PARP-1 siRNA和si-NC，未轉(zhuǎn)染的HGC-27細(xì)胞為空白對照。轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。以下實驗每組細(xì)胞設(shè)置3個平行孔，重復(fù)3次。

1.53組HGC-27細(xì)胞PARP-1mRNA和蛋白表達(dá)的檢測轉(zhuǎn)染48 h后提取3組HGC-27細(xì)胞的總RNA，同1.3方法檢測PARP-1 mRNA的表達(dá)。分別收集轉(zhuǎn)染48 h后各組HGC-27細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，在蛋白樣品中加入適量加樣緩沖液，沸水浴中加熱15 min致蛋白變性。在上樣孔中加入等量變性蛋白樣品，行SDS-PAGE電泳，分離蛋白后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，置于含50 g/L脫脂奶粉中封閉2 h。加入PARP-1一抗(1∶800稀釋)，4 ℃下過夜。再加入按1∶3 000稀釋的二抗，室溫下1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光，顯影，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.63組HGC-27細(xì)胞增殖能力的檢測轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h時，分別取3組細(xì)胞，每孔細(xì)胞中加入CCK-8試劑10 μL，置37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處吸光度(A)值。

1.73組HGC-27細(xì)胞凋亡檢測分別收集轉(zhuǎn)染48 h后3組HGC-27細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，采用Annexin-Ⅴ/PI雙染法，室溫下避光進(jìn)行，再加入400 μL結(jié)合緩沖液，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.83組HGC-27細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)的檢測采用Western blot法檢測3組HGC-27細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8蛋白的表達(dá)，方法同1.5，其中Caspase-3和Caspase-8一抗均按1∶1 000稀釋。

1.93組HGC-27細(xì)胞放射敏感性檢測轉(zhuǎn)染48 h后，3組HGC-27細(xì)胞分別接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別給予6 MV X射線(單次劑量為0、2、4、6、8 Gy)照射6 h后于37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)2周，用多聚甲醛固定30 min，吉姆薩染色15 min，洗去染液后晾干，在顯微鏡下觀察、計數(shù)，以>50個細(xì)胞的克隆為有效克隆，克隆形成率=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用單因素方差分析比較不同細(xì)胞間PARP-1 mRNA表達(dá)的差異，以及3組HGC-27細(xì)胞PARP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平、增殖能力、凋亡率、克隆形成率和Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)的差異，兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.16種細(xì)胞中PARP-1mRNA表達(dá)水平的比較GES-1、MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27細(xì)胞中PARP-1 mRNA的表達(dá)水平分別為(0.86±0.10)、(1.42±0.16)、(1.39±0.15)、(2.42±0.30)、(1.87±0.22)、(3.28±0.35)，PARP-1在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)均高于GES-1(P<0.05)，且在HGC-27細(xì)胞中表達(dá)量最高，因此選擇HGC-27細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.23組HGC-27細(xì)胞中PARP-1表達(dá)水平的比較轉(zhuǎn)染48 h后，si-PARP-1組HGC-27細(xì)胞中PARP-1 mRNA和蛋白表達(dá)低于空白對照組和si-NC組(P<0.05)，而si-NC組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示轉(zhuǎn)染PARP-1 siRNA能夠干擾胃癌HGC-27細(xì)胞PARP-1的表達(dá)。見圖1和表1。

1～3：分別為空白對照組、si-NC組和si-PARP-1組

表1 3組HGC-27細(xì)胞中PARP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

2.33組HGC-27細(xì)胞增殖能力比較轉(zhuǎn)染48、72和96 h，與空白對照組和si-NC組相比，si-PARP-1組HGC-27細(xì)胞A值降低，提示細(xì)胞增殖能力減弱，見表2。

表2 3組HGC-27細(xì)胞增殖能力比較(n=3)

2.43組HGC-27細(xì)胞凋亡率及Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平的比較與空白對照組和si-NC組相比，si-PARP-1組HGC-27細(xì)胞凋亡率升高，Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖2和表3。

1～3：分別為空白對照組、si-NC組和si-PARP-1組

表3 3組HGC-27細(xì)胞凋亡率及Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平比較(n=3)

2.53組HGC-27細(xì)胞放射敏感性的比較與空白對照組和si-NC組相比，不同照射劑量下si-PARP-1組細(xì)胞克隆形成率均降低(P<0.05)，見表4。

表4 不同照射劑量下3組細(xì)胞克隆形成率比較(n=3) %

3 討論

胃癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大常見原因；胃癌的發(fā)生率在世界不同地區(qū)之間存在明顯差異，在東亞尤其常見[10]。雖然手術(shù)是胃癌的主要治療方法，但放射治療在胃癌的輔助和姑息治療中也起著重要作用，而腫瘤細(xì)胞的放射敏感性決定了放療效果。放射治療的分子機(jī)制主要是通過電離輻射損傷DNA雙鏈，而多種修復(fù)途徑通過修復(fù)DNA損傷降低放射治療效果[11]。研究[12]證實，PARP-1基因具有DNA損傷修復(fù)的功能，可修復(fù)電離輻射導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂，因此靶向抑制PARP-1的表達(dá)對放射增敏具有重要意義。有研究[13]顯示，PARP-1的高表達(dá)與胃癌的侵襲和預(yù)后不良密切相關(guān)。但有關(guān)PARP-1基因參與胃癌細(xì)胞放射敏感性的研究鮮見報道。

本實驗首先通過qRT-PCR檢測了人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及不同胃癌細(xì)胞中PARP-1 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PARP-1 mRNA在胃癌細(xì)胞尤其是HGC-27細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于GES-1細(xì)胞。將特異性PARP-1 siRNA轉(zhuǎn)染HGC-27細(xì)胞，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染特異性PARP-1 siRNA可有效干擾PARP-1的表達(dá)，且轉(zhuǎn)染后HGC-27細(xì)胞增殖受抑，細(xì)胞凋亡率升高，Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平升高；接受不同劑量X射線照射后，干擾PARP-1表達(dá)的HGC-27細(xì)胞克隆形成率降低，表明干擾PARP-1基因可提高HGC-27細(xì)胞的放射敏感性，這與Feng等[14]在乳腺癌，K?tter等[15]在胰腺癌PC3細(xì)胞、宮頸癌HeLa細(xì)胞和肺腺癌H1299細(xì)胞等中的研究相符。研究[16-17]顯示Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的最終執(zhí)行者，其激活可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而Caspase-8是細(xì)胞凋亡通路中的啟動基因，可激活下游Caspase-3。因此推測PARP-1影響胃癌細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制可能與Caspase-8/Caspase-3途徑有關(guān)。

綜上，干擾PARP-1基因可抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞的放射敏感性；PARP-1基因有望成為胃癌基因治療的新靶點。干擾PARP-1基因是否通過Caspase-8/Caspase-3途徑影響胃癌細(xì)胞的放射敏感性有待驗證。此外，本實驗在干擾PARP-1基因后只通過Western blot法檢測Caspase-3和Caspase-8蛋白的表達(dá)水平，未涉及Caspase-8/Caspase-3途徑上下游基因的變化，存在不足，后續(xù)實驗將對此進(jìn)行補(bǔ)充并驗證。