徐紀中，袁維堂，王貴憲，周全博，胡晟云

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 鄭州 450052

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計[1]全球每年CRC新發(fā)病例約150萬，我國約占20%，且我國CRC發(fā)病率占所有惡性腫瘤第6位，目前隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變及生活節(jié)奏的加快，發(fā)病率仍呈上升趨勢，給人們的生命健康造成嚴重威脅。近年來研究[2]表明，微小RNA(miRNA)表達或功能異常與CRC發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，部分miRNA已被視為抑癌基因或癌基因。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，mir-34b/c在CRC中的表達呈現(xiàn)個體差異性、組織差異性及種族差異性，具有單核苷酸多態(tài)性，參與調(diào)控GATA-X、p53、Bcl-2等多種靶基因及其相關(guān)信號通路基因，通過干擾靶基因功能而改變生物學(xué)過程，與CRC遺傳易感性及預(yù)后關(guān)系密切。目前關(guān)于mir-34b/c單核苷酸多態(tài)性與CRC遺傳易感性及疾病預(yù)后關(guān)系的研究尚鮮有報道。本研究對180例接受根治性切除術(shù)治療的河南漢族CRC患者mir-34b/c基因rs4938723多態(tài)性與CRC遺傳易感性及術(shù)后生存狀況的關(guān)系進行了分析，報道如下。

1 對象與方法

1.1一般資料收集2014年7月至2016年7月我院收治的180例CRC患者(CRC組)的資料。病例納入標準：①均接受根治性切除術(shù)，且術(shù)后病理檢查確診為CRC。②參照中華醫(yī)學(xué)會指南[5]，術(shù)后根據(jù)腫瘤性質(zhì)制定抗癌綜合治療方案，包括放化療、免疫治療等。③患者間無血緣關(guān)系。④均為河南籍漢族人。⑤卡式行為狀態(tài)評分[6]≥70分。⑥患者均簽署知情同意書。排除標準：①合并嚴重肝腎功能不全者。②術(shù)前接受放療、生物靶向治療者。③合并肛管癌、家族性結(jié)腸腺瘤性息肉病惡變者或其他部位原發(fā)性惡性腫瘤者。④妊娠期或哺乳期婦女。⑤精神狀態(tài)異常者。CRC患者中男105例，女75例；年齡28～75(63.2±10.5)歲；結(jié)腸癌95例，直腸癌85例；美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)分期[7]Ⅰ期34例，Ⅱ期82例，Ⅲ期49例，Ⅳ期15例。另選取同期我院體檢中心180名體檢健康人群(對照組)，其中男108例，女72例；年齡30～70(62.5±10.2)歲。該研究獲我院倫理委員會審批。

1.2mir-34b/c基因rs4938723多態(tài)性檢測取術(shù)前CRC患者和健康受試者空腹靜脈血4 mL，加入抗凝管。取抗凝血0.5 mL，與等量細胞裂解液混勻，離心后取沉淀，加入250 μL酚/氯仿混合液充分混勻，離心取上清，與等體積氯仿充分混勻，再次離心取上清，加入無水乙醇充分混勻，離心后棄去上清，重復(fù)無水乙醇操作，室溫風干，-20 ℃?zhèn)溆谩?采用PCR-RFLP法檢測mir-34b/c基因rs4938723多態(tài)性：參照PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書操作，擴增目的片段。mir-34b/c rs4938723引物序列：F為5’-ATGCTAAACGCTAGTCATGC-3’，R為 5’-ATTGCTGTAGTCTGATGCTT-3’。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，42個循環(huán)；然后72 ℃延伸5 min。設(shè)定RELP反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物4.0 μL，Buffer緩沖液1.0 μL，Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶1.0 μL，ddH2O 9.0 μL，37 ℃水浴酶切，產(chǎn)物送上海生工測序驗證。酶切產(chǎn)物進行30 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照。野生純合型(TT)為1個條帶，突變雜合型(TC)為3個條帶，CC型為2個條帶?；蚍中统晒β?00%。

1.3臨床資料的收集及隨訪收集對照組及CRC患者術(shù)前臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、吸煙史(吸煙>5支/d，煙齡≥5 a)、飲酒史(飲酒量>40 g/d，酒齡≥5 a)、AJCC分期及mir-34b/c基因型。以病例查詢或電話隨訪方式明確CRC患者生存狀況，術(shù)后至少每3個月隨訪1次，隨訪截止時間為2019年7月，終點事件為結(jié)直腸癌導(dǎo)致的死亡。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SHEsis軟件對對照組mir-34b/c基因rs4938723基因型頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用SPSS19.0分析處理數(shù)據(jù)，CRC組和對照組性別、飲酒史、吸煙史的比較采用χ2檢驗，年齡、BMI的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；應(yīng)用Kaplan-Meier法對不同基因型CRC患者繪制生存曲線并進行l(wèi)og-rank檢驗，采用Cox回歸模型分析mir-34b/c基因型與CRC預(yù)后的關(guān)系。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1CRC組與對照組一般資料的比較見表1。結(jié)果顯示CRC組與對照組性別、年齡、BMI、飲酒史、吸煙史比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 CRC組與對照組一般資料的比較

2.2CRC組與對照組mir-34b/c基因rs4938723基因型及等位基因頻率的比較對照組mir-34b/c基因rs4938723基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.293,P=0.134)，提示本研究所選群體代表性良好。CRC組C等位基因頻率高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 2組mir-34b/c rs4938723基因型及等位基因頻率比較 例(%)

2.3不同基因型CRC患者生存曲線的比較隨訪時間36～54個月，Kaplan-Meier生存曲線見圖1。結(jié)果顯示TT基因型與TC+CC基因型患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.283，P=0.038)，TC+CC基因型患者的預(yù)后差于TT基因型患者。

圖1 不同基因型CRC患者的生存曲線

2.4mir-34b/c基因rs4938723多態(tài)性與CRC預(yù)后的關(guān)系以性別(女為0，男為1)、年齡(<60歲為0，≥60歲為1)、飲酒史(無為0，有為1)、吸煙史(無為0，有為1)、BMI(以18.5～23.9 kg/m2為對照進行啞變量化)、AJCC分期(以Ⅰ期為對照進行啞變量化)為調(diào)整變量，以基因型(以TT基因型為對照進行啞變量化)為自變量，進行Cox回歸分析，結(jié)果(表3)顯示，TC、CC型是CRC 預(yù)后不良的危險因素。

表3 Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

CRC發(fā)病機制十分復(fù)雜，近年來隨著分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)機體長期暴露于環(huán)境、飲食等多種致癌因素時，CRC發(fā)病風險升高，但仍存在個體差異，可能與遺傳基因突變導(dǎo)致易感性增加有關(guān)[8-10]。mir-34b/c基因參與機體多種病理、生理反應(yīng)，其啟動子區(qū)多態(tài)性與該基因功能關(guān)系密切[11-12]。rs4938723位點位于mir-34b/c基因CpG島，可能通過與Notch1堿基互補配對結(jié)合，從而激活或抑制Notch1信號通路，調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化過程[13]。p53基因具有修復(fù)細胞基因缺陷、防止癌變、促進癌變細胞凋亡的功能，是重要的抑癌基因。mir-34家族是抑癌基因p53的直接靶基因，mir-34家族基因表達和功能異常可直接影響p53介導(dǎo)的信號通路異常，導(dǎo)致細胞癌變風險增加[14]。GATA-X基因是含鋅指結(jié)構(gòu)組織中特異性表達的轉(zhuǎn)錄因子，該基因失活可導(dǎo)致細胞無限分裂增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究[15]表明，mir-34b/c基因突變可引起GATA-X基因功能異常，可能導(dǎo)致CRC發(fā)病風險增加。本研究結(jié)果顯示，河南漢族CRC患者mir-34b/c基因rs4938723的突變的C等位基因分布頻率升高，提示mir-34b/c基因rs4938723多態(tài)性與河南漢族人群CRC遺傳易感性關(guān)系密切，推測與rs4938723位點突變導(dǎo)致的下游抑癌基因失活、癌基因激活有關(guān)，這些變化進而激活細胞癌變信號通路，增加CRC易感性。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與CRC疾病進展及預(yù)后關(guān)系密切。Jiang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，mir-34a/b/c基因敲除小鼠腫瘤負荷分級較未敲除鼠增加，且成纖維細胞生長因子受體1、受體酪氨酸激酶等淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在腫瘤組織中高表達，小鼠生存期縮短。周聯(lián)明等[17]研究證實CRC患者血清mir-34c表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和腫瘤直徑負相關(guān)，在CRC

侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本研究分析結(jié)果顯示，TC+CC基因型CRC患者預(yù)后狀況差于TT型患者，TC、CC基因型是CRC預(yù)后不良的危險因素。

綜上所述，mir-34b/c基因rs4938723多態(tài)性與河南漢族人群CRC遺傳易感性關(guān)系密切，且TC、CC基因型患者預(yù)后不良風險較高。該結(jié)論為CRC的診斷及個體化治療提供了參考依據(jù)，但mir-34b/c基因多態(tài)性對CRC發(fā)生發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸的影響機制仍需要進一步研究。