羅沙沙，李芬芬，謝小倩，王亞樂(lè)，趙則月，李曉天

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 鄭州 450001

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以對(duì)稱(chēng)性、持續(xù)性關(guān)節(jié)腫脹和疼痛為主要表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病[1]。目前臨床上均推薦甲氨蝶呤作為治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的首選藥物[2]，但長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，如肝臟損傷。穿心蓮內(nèi)酯是具有保肝利膽、解熱抗炎等作用的二萜內(nèi)酯類(lèi)化合物。目前有研究[3]發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可以減少炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有治療作用。已有文獻(xiàn)[4]報(bào)道穿心蓮內(nèi)酯具有抗肝毒性作用。肝毒性是甲氨蝶呤長(zhǎng)期治療關(guān)節(jié)炎的常見(jiàn)不良反應(yīng)[5]，如血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量增加[6]。本研究采用穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合甲氨蝶呤治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠，觀察治療效果，并通過(guò)檢測(cè)血清中AST和ALT含量評(píng)價(jià)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)甲氨蝶呤誘導(dǎo)肝損傷的治療效果。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑及儀器YLS-6B智能熱板儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)，生理鹽水(石家莊四藥有限公司)，弗氏完全佐劑(10 g/L,北京博蕾德生物科技有限公司)，穿心蓮內(nèi)酯與甲氨蝶呤(大連美倫生物技術(shù)有限公司)，AST與ALT檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理雄性Wistar大鼠32只，體重(140±20) g，大鼠及飼料均購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證編號(hào)：ZYXY 2017-0005)；采用標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲用水喂養(yǎng)，溫度20～25 ℃，濕度55%～65%，光照12 h/d。動(dòng)物墊料每周更換2次，喂養(yǎng)過(guò)程按照清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作規(guī)程來(lái)進(jìn)行。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒，于大鼠右后足皮下注射弗氏完全佐劑0.1 mL，然后采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、甲氨蝶呤組、穿心蓮內(nèi)酯組、聯(lián)合組，每組8只。第11～38天，甲氨蝶呤組大鼠每周2次腹腔注射甲氨蝶呤溶液5 mL/kg(0.2 g/L甲氨蝶呤的給藥劑量為 2 mg/kg[7])，穿心蓮內(nèi)酯組大鼠每天灌胃穿心蓮內(nèi)酯溶液10 mL/kg(5 g/L穿心蓮內(nèi)酯溶液給藥劑量為50 mg/kg[8])，聯(lián)合用藥組大鼠除每周2次腹腔注射甲氨蝶呤溶液外每日灌胃給予穿心蓮內(nèi)酯溶液10 mL/kg，對(duì)照組大鼠每天灌胃等體積的5 g/L羧甲基纖維素鈉溶液。在第38天測(cè)量大鼠足厚度、足周長(zhǎng)、關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)、熱板實(shí)驗(yàn)?zāi)褪軙r(shí)間；第39天，各組大鼠麻醉后取血分離血清用于血清中AST、ALT含量的測(cè)定，處死大鼠后取右后肢踝關(guān)節(jié)組織用于HE染色。

1.3大鼠類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的評(píng)估

1.3.1 足厚度及足周長(zhǎng)的測(cè)定 將大鼠置于足趾測(cè)量?jī)x配套大鼠固定架中，使用游標(biāo)卡尺、軟尺分別測(cè)量右后足足厚度和足周長(zhǎng)，平行測(cè)量3次取均值。

1.3.2 后肢AI測(cè)定 觀察大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)情況，并對(duì)大鼠后肢進(jìn)行AI測(cè)定。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：關(guān)節(jié)正常，0分；關(guān)節(jié)或足趾發(fā)紅，1分；關(guān)節(jié)或足趾發(fā)紅、輕度腫脹，2分；關(guān)節(jié)或足趾重度腫脹，3分；關(guān)節(jié)變形、強(qiáng)直，4分。結(jié)果取兩后肢評(píng)分之和，最高8分。

1.3.3 熱板實(shí)驗(yàn)?zāi)褪軙r(shí)間測(cè)定 捉持大鼠讓大鼠右后足足底接觸溫度為(52.0±0.2) ℃熱板，大鼠受熱刺激而產(chǎn)生明顯的后抽動(dòng)作作為疼痛的反應(yīng)指標(biāo)，記錄大鼠產(chǎn)生痛反應(yīng)所需時(shí)間。每只大鼠平行測(cè)試2次取均值，每次測(cè)試間隔不應(yīng)小于15 min。

1.4大鼠血清AST、ALT測(cè)定麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，血樣靜置30 min后于離心機(jī)上3 000 r/min離心15 min，取血清置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。利用AST、ALT檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中AST、ALT含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5大鼠踝關(guān)節(jié)組織HE染色處死大鼠后，取大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)浸泡于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中固定過(guò)夜，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋， 4 μm厚切片，二甲苯脫蠟，HE染色，在顯微鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同組間大鼠足厚度、足周長(zhǎng)、AI、耐受時(shí)間、血清AST及ALT含量的比較均采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎指標(biāo)的比較見(jiàn)表1。甲氨蝶呤及穿心蓮內(nèi)酯均可改善大鼠足厚度、足周長(zhǎng)、AI及耐受時(shí)間等指標(biāo)；兩藥聯(lián)用可表現(xiàn)出協(xié)同作用，進(jìn)一步減少大鼠足周長(zhǎng)，延長(zhǎng)耐受時(shí)間。

表1 各組大鼠類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎指標(biāo)的比較

2.2各組大鼠血清中AST及ALT含量的比較結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，甲氨蝶呤單獨(dú)使用升高大鼠血清中AST、ALT含量，穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)使用降低大鼠血清中AST、ALT含量；兩藥聯(lián)用，可表現(xiàn)出拮抗作用。

表2 各組大鼠血清AST及ALT含量的比較U/L

2.3各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織HE染色結(jié)果對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，滑膜增厚，關(guān)節(jié)腔隙狹窄，軟骨侵蝕(圖1A)；甲氨蝶呤組及穿心蓮內(nèi)酯組大鼠關(guān)節(jié)腔未見(jiàn)滑膜增厚，軟骨侵蝕情況較輕(圖1B、C)；聯(lián)合組大鼠踝關(guān)節(jié)邊緣較清晰，炎性細(xì)胞明顯減少，未見(jiàn)滑膜增厚(圖1D)。

A：對(duì)照組；B：甲氨蝶呤組；C：穿心蓮內(nèi)酯組；D：聯(lián)合組

3 討論

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)破壞性炎癥疾病，以滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及出現(xiàn)新生血管等為特征[9]。本研究通過(guò)析因設(shè)計(jì)，探討甲氨蝶呤、穿心蓮內(nèi)酯兩藥的相互作用，研究證實(shí)甲氨蝶呤及穿心蓮內(nèi)酯均能改善大鼠類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎指標(biāo)，如足厚度、足周長(zhǎng)、AI、耐受時(shí)間，且兩藥存在交互作用，穿心蓮內(nèi)酯可以增強(qiáng)甲氨蝶呤的抗炎作用，減輕類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥狀態(tài)；本研究發(fā)現(xiàn)，甲氨蝶呤單獨(dú)使用，大鼠血清AST、ALT含量均升高；穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)使用，大鼠血清AST、ALT含量均降低，且兩藥聯(lián)用表現(xiàn)出相互拮抗作用，說(shuō)明穿心蓮內(nèi)酯可改善類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中甲氨蝶呤引發(fā)的肝毒性。

有研究[10]表明，穿心蓮內(nèi)酯可以通過(guò)抑制NF-κB和激活Nrf2信號(hào)通路來(lái)保護(hù)肝臟；且穿心蓮葉的乙醇提取物可以預(yù)防硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝硬化，與其降低活性氧水平有關(guān)[11]。近期研究[12]表明，大黃酸可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平下調(diào)促細(xì)胞凋亡基因bax的表達(dá)，通過(guò)Nrf2-HO-1途徑改善甲氨蝶呤介導(dǎo)的肝損傷；小檗堿可以清除活性氧物質(zhì)，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，抵抗甲氨蝶呤誘導(dǎo)的大鼠肝毒性[13]。進(jìn)而推測(cè)穿心蓮內(nèi)酯治療甲氨蝶呤誘發(fā)的肝毒性，可能與其抗炎抗氧化藥理活性有關(guān)。

本研究建立弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的Wistar大鼠類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯不僅可以治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，還能減弱甲氨蝶呤的肝毒性。