王嘉怡，劉寶寶，張港琛，李金朋，毛晨龍，樊擎瑩，汪 洋

（河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/洛陽(yáng)市畜禽分子病原與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種重要的人畜共患病病原體。豬體帶菌率接近100%，致死率將近20%[1]。SS 能夠粘附于宿主細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白，包括纖連蛋白和膠原蛋白，同時(shí)也能粘附于宿主內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞上而造成持續(xù)性感染。SS 已被證實(shí)能夠形成生物被膜狀態(tài)，而體內(nèi)細(xì)菌的生物被膜狀態(tài)也可能是其引起持續(xù)感染的原因之一[2]。細(xì)菌生物被膜（Biofilm，BF）是細(xì)菌粘附于異物或組織表面，通過(guò)分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白等復(fù)合物使細(xì)菌相互黏連、聚集，形成立體膜樣結(jié)構(gòu)，是細(xì)菌微菌落聚集體。細(xì)菌生物被膜狀態(tài)被認(rèn)為是細(xì)菌適應(yīng)惡劣環(huán)境而形成的一種保護(hù)模式，導(dǎo)致其對(duì)抗生素及宿主的免疫反應(yīng)不敏感[3]。

強(qiáng)力霉素和慶大霉素是用于預(yù)防和治療SS 感染最有效的抗生素，但由于口服吸收率低和藥物本身代謝動(dòng)力學(xué)原因，其通常在豬體內(nèi)以低于其對(duì)SS 的最小抑菌濃度（即亞抑菌濃度）水平存在[4]。研究表明亞抑菌濃度抗生素可以作為信號(hào)分子誘導(dǎo)細(xì)菌生物被膜的形成，同時(shí)通過(guò)降低細(xì)菌毒力因子表達(dá)來(lái)利于其生存[5]。SS 最常見(jiàn)的關(guān)鍵毒力因子有莢膜多糖（CPS）、胞外因子（EF）、溶血素（SLY）、纖連蛋白結(jié)合蛋白（FBPS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）和磷酸甘油醛脫氧酶（GAPDH）[6]。亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素是否會(huì)影響SS 生物被膜的形成和毒力因子的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本研究對(duì)亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素作用下SS 生物被膜形成能力和毒力因子轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了初步研究，以期為臨床正確使用抗生素防止細(xì)菌感染提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料SS9801菌株（SS）是1998 年從江蘇省淮安縣某豬場(chǎng)感染豬中分離，具有良好的生物被膜形成能力，保存于含有20%甘油的TSB 培養(yǎng)基中，-20 ℃保存。

強(qiáng)力霉素和慶大霉素購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，并根據(jù)含量均制備成濃度為1 280 μg/mL；TSB（Todd-Hewitt Broth）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD 公司；TRIzol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 強(qiáng)力霉素和慶大霉素對(duì)SS 的最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定根據(jù)美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）規(guī)定的二倍稀釋法測(cè)定強(qiáng)力霉素和慶大霉素對(duì)SS 的MIC[7]。

1.3 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 生物被膜形成能力影響的檢測(cè)將TSB 液體培養(yǎng)基中的SS在37 ℃培養(yǎng)至終濃度為106cfu/mL，然后加入96 孔板中，再分別加入1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC 和1/16 MIC 強(qiáng)力霉素或慶大霉素于96 孔板中，以不加抗生素的孔為陰性對(duì)照，每組3 個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24 h 后用移液槍吸去浮游態(tài)SS，PBS 洗滌兩次，加入95%甲醇固定5 min 后每個(gè)孔加入200 μL（10%w/w）結(jié)晶紫，室溫染色10 min，風(fēng)干后加入200 μL 95%乙醇，5 min 后，檢測(cè)各組OD570nm值，根據(jù)該值分析SS生物被膜形成能力。

1.4 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 生長(zhǎng)影響的測(cè)定按1.4 方法加入相同濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素后將SS 在96 孔培養(yǎng)板中37 ℃培養(yǎng)，每小時(shí)取1 mL 培養(yǎng)菌液，測(cè)定OD600nm，繪制亞抑菌濃度培養(yǎng)條件下SS 的生長(zhǎng)曲線。

1.5 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 生物被膜內(nèi)活菌數(shù)影響的測(cè)定根據(jù)Andreia 等的方法對(duì)亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素作用下的生物被膜內(nèi)SS 活菌數(shù)量進(jìn)行測(cè)定[8]。按1.4 的方法培養(yǎng)SS 后加入96 孔板中，再分別加入1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC 和1/16 MIC 強(qiáng)力霉素或慶大霉素，以不加抗生素的孔為陰性對(duì)照，每組3 個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24 h。用移液槍去除浮游態(tài)SS，加入100 μL PBS 沖洗3 次后，每孔加入100 μL PBS，在超聲波水浴中間斷性超聲1 min，共處理10 次以破碎SS 生物被膜并保證被膜下SS 細(xì)胞的完整性[8]。將粘附于96 孔板孔壁和孔底的SS 的細(xì)胞重懸于PBS 中，二倍稀釋后在TSB固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)。

1.6 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 生物被膜形成的形態(tài)觀察根據(jù)1.6 所得結(jié)果將SS 分別于含有1/4 MIC 和1/8 MIC 強(qiáng)力霉素或1/2 MIC 和1/4 MIC 慶大霉素的2 mL TSB 培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后，按照1:100轉(zhuǎn)接至帶有爬片的24 孔板中，37 ℃培養(yǎng)36 h[9]，將爬片取出固定到載玻片上，用去離子水沖洗3 次，革蘭染色后鏡檢觀察SS 分布狀態(tài)。

1.7 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 毒力因子影響的檢測(cè)分別將1/4 MIC 和1/8 MIC 強(qiáng)力霉素或慶大霉素加到SS 菌液中， 37 ℃培養(yǎng)8 h，同時(shí)設(shè)不添加抗生素做陰性對(duì)照。利用TRIzol 法分別提取各組SS 的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，采用qRT-PCR 檢 測(cè) 后 利 用（2-ΔΔCT）方 法計(jì) 算 毒力 因 子cps、ef、sly、fbps、gdh和gapdh的轉(zhuǎn)錄水平[10]。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)。引物信息詳見(jiàn)表1。

表1 用于qRT-PCR 擴(kuò)增的毒力因子的引物Table 1 Primers used for the qRT-PCR analysis

1.8 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)用±s 表示，并且使用SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各試驗(yàn)均以未添加抗生素作為陰性對(duì)照組。數(shù)據(jù)利用單因素方差分析（ANOVA），p<0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 強(qiáng)力霉素和慶大霉素MIC 的測(cè)定結(jié)果經(jīng)二倍稀釋法測(cè)定強(qiáng)力霉素對(duì)SS 的MIC 為5 μg/mL；慶大霉素對(duì)SS 的MIC 為10 μg/mL。

2.2 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 形成生物被膜影響的測(cè)定結(jié)果在SS 中分別添加不同亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素和慶大霉素，經(jīng)結(jié)晶紫法測(cè)定SS的生物被膜形成能力。結(jié)果顯示，未添加抗生素的SS 的OD570nm平均值為0.29，添加1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC 和1/16 MIC 強(qiáng)力霉素后，SS OD570nm平均值分別為0.31、0.35、0.32 和0.33，明顯大于未添加抗生素的SS OD570nm值（p<0.05）；1/2 MIC 和1/4 MIC 慶大霉素作用下的SS 的OD570nm平均值分別為0.32 和0.34，SS 生物被膜形成能力明顯增強(qiáng)（p<0.01）。而1/8 MIC和1/16 MIC 慶大霉素作用下SS 的OD570nm平均值分別為0.290 和0.30，對(duì)SS 的生物被膜形成無(wú)影響（圖1）。結(jié)果表明在亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素（1/2 MIC～1/16 MIC）或慶大霉素（1/2 MIC 和1/4 MIC）作用下，SS 生物被膜形成能力均增強(qiáng)。

圖1 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 生物被膜形成能力影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Effect of sub-MICs of doxycycline or gentamicin on biofilm formation of SS

2.3 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 生長(zhǎng)影響的測(cè)定結(jié)果在培養(yǎng)SS 的96 孔板中分別加入不同亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素或慶大霉素，每1 h 取培養(yǎng)液測(cè)定OD600nm值繪制SS 的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，分別在1/2 MIC～1/16 MIC 強(qiáng)力霉素作用下，SS 的生長(zhǎng)與未添加抗生素相比其前期生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)速率減緩，但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其生長(zhǎng)逐漸恢復(fù)（圖2A）。分別在1/4 MIC、1/8 MIC 或1/16 MIC 慶大霉素作用下，SS 生長(zhǎng)曲線與未添加抗生素相比其前期生長(zhǎng)速度減慢；在1/2 MIC 慶大霉素作用下，SS 的前期生長(zhǎng)明顯受到抑制，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其生長(zhǎng)逐漸恢復(fù)（圖2B）。結(jié)果表明不同亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素或慶大霉素均減緩了SS 的生長(zhǎng)速率，但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其生長(zhǎng)逐漸恢復(fù)。

圖2 亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素（A）和慶大霉素（B）作用下的SS 生長(zhǎng)曲線（n=3，±s）。Fig.2 Growth curves of SS at the sub-MICs of doxycycline(A)and gentamicin(B)(n=3,±s)

2.4 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 被膜內(nèi)活菌數(shù)影響的測(cè)定結(jié)果采用活菌計(jì)數(shù)法對(duì)不同亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素或慶大霉素作用下的生物被膜內(nèi)SS 活菌數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，分別在1/4 MIC 和1/8MIC 強(qiáng)力霉素作用下，SS 生物被膜內(nèi)活菌數(shù)量與未添加抗生素對(duì)照相比顯著增加（p<0.001），而分別在1/2 MIC 和1/16MIC 強(qiáng)力霉素作用下SS 生物被膜內(nèi)的活菌數(shù)量變化不明顯；在1/2 MIC 和1/4 MIC 慶大霉素作用下，SS 生物被膜內(nèi)活菌數(shù)量與未添加抗生素對(duì)照相比顯著增加（p<0.001），而分別在1/8 MIC 和1/16 MIC 慶大霉素作用下SS 生物被膜內(nèi)活菌數(shù)量變化不明顯（圖3）。表明1/4 MIC 和1/8 MIC強(qiáng)力霉素或1/2MIC 和1/4MIC 慶大霉素均增加了生物被膜內(nèi)SS 的活菌數(shù)量。

2.5 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 生物被膜形成的形態(tài)觀察分別在1/4 MIC 和1/8 MIC 強(qiáng)力霉素或分別在1/2 MIC 和1/4 MIC 慶大霉素中培養(yǎng)SS后，經(jīng)革蘭染色后鏡檢。結(jié)果可見(jiàn)，當(dāng)加入上述濃度的強(qiáng)力霉素或慶大霉素時(shí)，經(jīng)顯微鏡均能觀察到明顯的SS 集聚成團(tuán)現(xiàn)象，而未添加抗生素的SS 則集聚不明顯（圖4）。表明亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素或慶大霉素均能夠促進(jìn)SS 形成聚集狀態(tài)利于其生物被膜的形成。

圖3 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素和慶大霉素對(duì)SS 生物被膜中活菌數(shù)影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Effect of sub-MICs of doxycycline or gentamicin on viable cell counts of SS in biofilm

圖4 1/4 MIC 和1/8 MIC 強(qiáng) 力 霉 素 或1/2 MIC 和1/4 MIC慶大霉素素對(duì)SS 分布狀態(tài)的影響觀察結(jié)果（100×）Fig.4 Effect of 1/4 MIC and 1/8 MIC of doxycycline or 1/2 MIC and 1/4 MIC gentamicin on the SS distribution state(100×)

2.6 亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 毒力因子轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果將SS 分別置于1/4 MIC 和1/8 MIC 強(qiáng)力霉素或分別置于相同濃度的慶大霉素中培養(yǎng)8 h 后，提取各組SS 總RNA 反轉(zhuǎn)錄后，采用qRT-PCR 檢測(cè)各組SS 的毒力因子轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，當(dāng)分別添加1/4MIC 和1/8MIC 的強(qiáng)力霉素或慶大霉素時(shí)，SS 毒力因子cps、ef、sly、fbps、gdh 和gap?dh 的轉(zhuǎn)錄水平與未添加抗生素的SS 毒力因子相比均顯著下降（p<0.01）（圖5）。表明亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素或慶大霉素均能夠抑制SS 毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平。

圖5 1/4 MIC 和1/8 MIC 強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)SS 毒力因子轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Effect of 1/4 MIC and 1/8 MIC of doxycycline or gentamicin on transcription levels of virulence factors of SS

3 討 論

近年來(lái)，在動(dòng)物飼養(yǎng)和治療過(guò)程中濫用抗生素現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，已經(jīng)導(dǎo)致多重耐藥菌株的出現(xiàn)和傳播。早期預(yù)防或者治療畜禽相關(guān)細(xì)菌病最常用的方法是將抗生素添加到水或飼料以口服的方式攝取，但由于藥代動(dòng)力學(xué)等原因，抗生素大多以低于其最低抑菌濃度（即亞抑菌濃度）存在于動(dòng)物體內(nèi)[11]。研究表明亞抑菌濃度抗生素可以增強(qiáng)細(xì)菌生物被膜的形成能力從而造成其持續(xù)性感染[12]。SS 在豬體內(nèi)常以生物被膜形式定植生存，導(dǎo)致感染反復(fù)且難以控制[13]。亞抑菌濃度抗生素對(duì)SS 生物被膜形成能力和毒力因子的影響很少有文獻(xiàn)報(bào)道。強(qiáng)力霉素和慶大霉素在預(yù)防SS 感染中常以亞抑菌濃度作為飼料添加劑[14-15]。因此，探究亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素和慶大霉素對(duì)SS 生物被膜形成能力和毒力因子轉(zhuǎn)錄水平的影響，可以對(duì)臨床正確使用該類抗生素防止細(xì)菌持續(xù)性感染提供參考依據(jù)。

本研究首先檢測(cè)亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素和慶大霉素對(duì)SS 生物被膜形成能力的影響。結(jié)果表明1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC 和1/16 MIC 的強(qiáng)力霉素和1/2 MIC、1/4 MIC 的慶大霉素均提高了SS 生物被膜形成能力。生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，不同亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素或慶大霉素均減緩了SS 的生長(zhǎng)速率，但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其生長(zhǎng)特性恢復(fù)。Haas 等人利用亞抑菌濃度阿莫西林處理的SS P1/7 株具有類似的生長(zhǎng)模式，這種生長(zhǎng)模式可能有助于促進(jìn)SS 生物被膜的形成[16]?；诖?，本研究進(jìn)一步探究不同亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素和慶大霉素對(duì)SS 生物被膜活菌數(shù)量影響，結(jié)果表明，在亞抑菌濃度強(qiáng)力霉素（1/4 MIC 和1/8 MIC）或慶大霉素（1/2 MIC 和1/4 MIC）作用下生物被膜內(nèi)SS 活菌數(shù)量明顯增加。經(jīng)顯微鏡觀察在此濃度作用下，SS 集聚程度也均明顯增加。以上結(jié)果表明亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素和慶大霉素可以增強(qiáng)SS 生物被膜的形成能力。

Bruchmann 等觀察到亞抑菌濃度的抗生素能夠增加細(xì)菌生物被膜的生物量和厚度，同時(shí)誘導(dǎo)生物被膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而影響生物被膜中細(xì)菌的致病能力[17]。劉湛軍等的研究表明亞抑菌濃度抗生素可以作為信號(hào)分子發(fā)揮作用，如誘導(dǎo)紫色桿菌毒力因子表達(dá)，形成生物被膜和調(diào)控菌群密度感應(yīng)系統(tǒng)[18]。Ahmed 等的研究表明在亞抑菌濃度四環(huán)素作用下，肺炎鏈球菌中生物被膜形成能力和被膜內(nèi)活菌數(shù)增加，可能受到LuxS/AI-2 密度感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控[19]。Mlynek 等的研究表明亞抑菌濃度阿莫西林可以誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌細(xì)胞外基因（eDNA）的表達(dá)，從而刺激其生物被膜的形成[20]。本研究亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素和慶大霉素增強(qiáng)SS 生物被膜形成能力的機(jī)制推測(cè)可能也是通過(guò)密度感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑或通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

在前期培養(yǎng)階段發(fā)現(xiàn)，在1/2 MIC 慶大霉素作用下SS 的活菌數(shù)量受到影響，但1/4 MIC 和1/8 MIC強(qiáng)力霉素或慶大霉素對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)影響。因此本研究選擇1/4 MIC 和1/8 MIC 強(qiáng)力霉素或慶大霉素探究其對(duì)SS 毒力因子轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，在此濃度的強(qiáng)力霉素或慶大霉素作用下，SS 毒力因子cps、ef、sly、fbps、gdh 和gapdh 轉(zhuǎn)錄水平均顯著下調(diào)，這些毒力因子在SS 感染和侵襲中起重要作用，其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)可能會(huì)降低SS 的毒力和致病性，從而形成其的持續(xù)性感染[21]。但具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明亞抑菌濃度的強(qiáng)力霉素和慶大霉素可以增強(qiáng)SS 生物被膜形成能力和降低其毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平從而形成其持續(xù)性感染，本研究為正確合理使用抗生素提供參考依據(jù)。