王玉玲 賴道華 潘晶晶 詹先強 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種接觸性傳染病，各日齡豬均可發(fā)病，1987年由美國首先報道。該病以妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎和仔豬呼吸道癥狀為主要特征，傳染性強，危害性大，還可繼發(fā)感染其他疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。目前，進行疫苗接種是預(yù)防、控制豬繁殖與呼吸綜合征最主要的措施之一。

根據(jù)《中國獸藥典》三部（二〇一〇年版）規(guī)定，豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗或毒種必須進行外源病毒檢驗，該項檢驗需用抗PRRSV特異性血清對樣品進行中和。因此，抗血清的中和效價和特異性對檢驗起著至關(guān)重要的作用。由于市場上能夠滿足獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)檢驗需求的豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性血清較少或抗體效價較低，難以滿足檢驗需要。目前，制備方法較多，報道各不一致，我們做了以下幾種比較試驗，以期找到一種簡便易行且免疫效價高的理想方法。

1 材料與方法

1.1 免疫抗原 豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗（CH-1R 株，效價為 106.0TCID50/頭份），由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司現(xiàn)為兆豐華生物科技（福州）有限公司生產(chǎn)；豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活疫苗（CH-1R株，滅活前病毒含量為106.5TCID50/0.1 mL），由實驗室自制。

1.2 試驗動物 動物為2 kg左右的成年健康雄性家兔。

1.3 佐劑 Freund完全佐劑及Freund不完全佐劑，均購自Invitrogen公司。

1.4 動物分組 根據(jù)免疫方法的不同分為如下幾組：四足掌、皮下、后大腿肌肉混合免疫組5只；皮下、肌肉免疫組1免疫5只；皮下、肌肉免疫組2免疫5只；靜脈、肌肉免疫組5只。

1.5 免疫方法

1.5.1 四足掌、皮下、后大腿肌肉混合免疫（A組）

1.5.1.1 基礎(chǔ)免疫 用制備好的抗原-Freund完全佐劑2 mL于家兔四足掌各注射0.2 mL，兩后大腿肌肉各注射0.3 mL，頸部皮下2點各注射0.3 mL，共計2 mL。

1.5.1.2 加強免疫 于基礎(chǔ)免疫4周后，每只家兔后大腿肌肉各注射0.5 mL不含佐劑的抗原。

1.5.2 皮下、肌肉免疫組1（B組）

1.5.2.1 基礎(chǔ)免疫1 取2 mL制備好的抗原-Freund完全佐劑于家兔背部皮下注射8個點，每點0.2 mL，共計 1.6 mL。

1.5.2.2 基礎(chǔ)免疫2 首次免疫2周后取制備好的抗原-freund不完全佐劑于家兔背部皮下注射8個點，每點0.3 mL；兩側(cè)腹股溝皮下各注射0.4 mL，兩側(cè)后大腿肌肉各注射0.6 mL，共計4.4 mL。

1.5.2.3 加強免疫1 間隔1周后每兔兩側(cè)腹股溝皮下各注射0.5 mL抗原。

1.5.2.4 加強免疫2 間隔1周后每兔兩側(cè)腹股溝皮下各注射0.5 mL抗原。

1.5.3 皮下、肌肉免疫2（C組）

1.5.3.1 基礎(chǔ)免疫1 取2 mL制備好的抗原-Freund完全佐劑于家兔頸部皮下注射2點，每點0.5 mL；兩側(cè)后大腿肌肉各注射0.5 mL。

1.5.3.2 基礎(chǔ)免疫2 首次免疫2周后取制備好的抗原-Freund不完全佐劑于家兔頸部皮下注射2點，每點1 mL；兩側(cè)后大腿肌肉各注射1 mL。

1.5.3.3 加強免疫1 間隔2周后取制備好的抗原-Freund不完全佐劑于家兔頸部皮下注射4點，每點0.5 mL；兩側(cè)后大腿肌肉各注射2 mL。

1.5.4 靜脈、肌肉免疫（D組）

1.5.4.1 基礎(chǔ)免疫1 取2 mL制備好的抗原-Freund完全佐劑于家兔靜脈注射2點，每點0.5 mL；兩側(cè)后大腿肌肉各注射0.5 mL。

1.5.4.2 基礎(chǔ)免疫2 首次免疫2周后取制備好的抗原-Freund不完全佐劑于家兔靜脈注射2點，每點1 mL；兩側(cè)后大腿肌肉各注射1 mL。

1.5.4.3 加強免疫1 間隔3周后取制備好的抗原-Freund不完全佐劑于家兔靜脈注射2點，每點2 mL；兩側(cè)后大腿肌肉各注射2 mL。

1.6 效價測定 首免后5周開始，每隔1周采集家兔心臟血一次，分離血清后進行抗體效價測定（ELISA法），取測定結(jié)果效價較高組別、周別的血清進行細胞中和法測定抗體效價。

2 結(jié)果與分析

共免疫家兔20只，D組大兔發(fā)生死亡，其他組別無生病死亡。

2.1 ELISA法測定抗體效價 結(jié)果見表1。

表1 ELISA法測定中和抗體效價結(jié)果

2.2 細胞中和法測定抗體效價 結(jié)果見表2。

免疫血清的質(zhì)量直接影響檢驗結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性，制備高效價的免疫血清不僅與抗原的自身性質(zhì)有關(guān)，同時與抗原的劑量、劑型、注射途徑、注射次數(shù)、間隔時間、佐劑應(yīng)用等因素有關(guān)。試驗選擇了四種不同的免疫方法分別在同一批隨機分組的家兔中進行免疫，結(jié)果各不相同。除靜脈免疫組外，其他幾種方法均在首免后6～7周出現(xiàn)抗體效價高峰值，但效價水平有所區(qū)別。

四足掌、皮下、后大腿肌肉混合免疫（A組）抗體效價大多可達1:20及其以上，最高達1:45。該方法簡單、操作簡便、整個方案簡潔明了，并且該方法所用抗原量較小，可以用于純化的微量抗原，免疫效果較好。

皮下、肌肉免疫（B，C組）因免疫途徑、免疫劑量和免疫程序不同，抗體效價情況也存在較大差異。其中C組抗體效價較高，抗體效價穩(wěn)定在1:25及以上。該方法所需抗原量較大，但免疫途徑最簡單（皮下和肌肉），可用于需求量較大的免疫血清的制備，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性血清的制備。

表2 細胞中和法測定中和抗體效價結(jié)果

靜脈、肌肉免疫（D組）因靜脈免疫滅活苗造成大兔在一免或二免后死亡，故無法測定抗體效價，也說明靜脈免疫方法因油乳劑的存在，造成機體較大損傷甚至死亡，故在進行油乳劑疫苗免疫時應(yīng)避免使用該方法。

三種不同的血清制備方法因抗原、免疫途徑、免疫程序等不同，抗體效價也存在差異。因此，通過本試驗對比發(fā)現(xiàn)，四足掌、皮下、后大腿肌肉混合免疫可以用于純化的微量抗原，皮下、肌肉免疫可用于需求量較大的免疫血清的制備，靜脈、肌肉免疫不適用于油乳劑疫苗的免疫。