吳曉龍，謝 艷，鄒吉鋒，李少俠，薛彩霞，寧桃麗，王 娜

(河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)，河南 洛陽(yáng) 471000)

人的高矮普遍被關(guān)注。而矮小身材常伴有體力差弱或智商低下等身體不良素質(zhì)。許多國(guó)家都很重視本國(guó)人民的身高，例如白俄羅斯將身材高挑的美女列為國(guó)家“戰(zhàn)略資源”[1],而日本更是通過(guò)每日一包奶提高中小學(xué)生身高發(fā)育。生長(zhǎng)激素是促進(jìn)人體長(zhǎng)高的第一要素，其主要在睡眠，尤其是慢波睡眠(SWS)期間分泌[2]。多數(shù)兒童在慢波睡眠期間分泌每日總量的50%～70%[3]。我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酸棗仁皂苷A可以促進(jìn)慢波睡眠的延長(zhǎng)，其機(jī)制是引起腦組織5-羥色胺1A受體(5-HT1AR)表達(dá)上調(diào)，同時(shí)生長(zhǎng)激素分泌旺盛，小鼠體長(zhǎng)較對(duì)照組增長(zhǎng)[4],此次我們發(fā)現(xiàn)腦組織Gi/o蛋白表達(dá)上調(diào)，而且我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藥物可以引起腦組織AC(腺苷酸環(huán)化酶)、cAMP(環(huán)磷酸腺苷)及PKA(蛋白激酶A)含量下降，這一切暗示藥物的作用途徑可能與cAMP-PKA通路相關(guān)?；诖?，本文探討酸棗仁提取物通過(guò)調(diào)控Gi/o蛋白表達(dá)抑制cAMP-PKA通路促進(jìn)小鼠骨骼增長(zhǎng)的作用機(jī)制，為其他有類似作用的藥物尋求作用靶點(diǎn)并提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康昆明種小鼠32只，SPF級(jí)，雄性，體重15～17g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(豫)2015-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24℃，濕度50%～70%，12h明暗交替，光照7：00～19:00，噪音<50dB。

1.2 藥物與試劑

酸棗仁皂苷A(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)A0274)，純度>98%。酸棗仁提取物(陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司)。小鼠生長(zhǎng)激素(GH)ELISA試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)201511)；小鼠5-羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)201510)；磷酸酶抑制劑蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Servicebio公司，貨號(hào)G2026)；TEMED (Amresco公司，貨號(hào)Amresc00761)；蛋白marker(Therm 公司，貨號(hào)26616)；PVDF膜(Millipore，貨號(hào)IPVH00010)；兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司，AB-P-R 001)；兔多抗5-HT1AR(Bioss公司，貨號(hào)Bs-1124r)；HRP標(biāo)記山羊抗兔(Servicebio公司，貨號(hào)GB23303)。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS，芬蘭，352型)；雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠，型號(hào)DYCZ-24DN)；轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠，型號(hào)DYCZ-40D)；脫色搖床(Servicebio公司，型號(hào)TSY-B)；冷凍離心機(jī)(heal force公司，型號(hào)neofuge 13R)；掌上離心機(jī)(Servicebio公司，型號(hào)D1008E)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組

來(lái)自同一天出生的8窩小鼠，4只/窩，隨機(jī)分為4組，分別是空白對(duì)照組、用藥組(酸棗仁提取物組)、陽(yáng)性對(duì)照組(酸棗仁皂苷A組)、Gi/O蛋白選擇性抑制劑組，每組8只，保證同一窩4只小鼠隨機(jī)分在不同的組，以去除遺傳的影響。用藥組灌胃酸棗仁提取物水溶液，按照0.320mg/g體重灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組灌胃酸棗仁皂苷A水溶液，藥物用純凈水溶解，按照0.013mg/g體重灌胃；Gi/O蛋白選擇性抑制劑組也灌胃酸棗仁提取物水溶液，方法同上，并于末次灌胃后側(cè)腦室注射百日咳毒素(PTX)0.4μg/只。

1.4.2 藥物對(duì)小鼠發(fā)育期體長(zhǎng)的影響

4組小鼠原始體長(zhǎng)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后開(kāi)始進(jìn)行灌胃操作，1次/日，灌胃后第20天分別麻醉動(dòng)物，測(cè)量小鼠體長(zhǎng)，從頭部最頂端到小鼠臀尾交接處即為小鼠體長(zhǎng)，數(shù)據(jù)精確到1mm。

1.4.3 測(cè)定小鼠血中生長(zhǎng)激素GH的含量

各組小鼠在測(cè)定體長(zhǎng)后麻醉狀態(tài)下進(jìn)行眼眶取血，在室溫下待血液自然凝固20min后，以離心半徑3 000r/min離心20min，收集上清液，采用ELISA試劑盒測(cè)定GH含量。

1.4.4 Gi/O蛋白蛋白質(zhì)印跡法(westernblot)檢測(cè)小鼠腦組織

眼眶取血后的小鼠立即脫頸椎處死，將一半腦組織稱重，RIPA充分裂解提取蛋白。將等量的2×SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液加入到收集的蛋白樣品中，用沸水浴加熱10min，使蛋白變性。等待樣品冷卻到室溫后，將蛋白樣品上樣加入到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，15μL/孔。濃縮膠電壓為80V，跑膠0.5h；分離膠電壓為120V，時(shí)間1.5h。將預(yù)先裁好的濾紙和PVDE在甲醇中浸泡3min，然后浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5min。將轉(zhuǎn)膜裝置放置好，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，把蛋白膜立即放置到Western洗滌液中進(jìn)行漂洗，時(shí)間為5min。隨后加入5%脫脂奶粉，在搖床上緩慢搖動(dòng)1h，進(jìn)行封閉。按照一抗、二抗說(shuō)明書進(jìn)行操作。TBST洗滌液進(jìn)行洗滌，10min每次，×3次。顯影、定影，沖洗膠片。用BandScan分析膠片灰度值。

1.4.5小鼠腦組織AC活性、cAMP、PKA含量的檢測(cè)

剩余的一半腦組織加入PBS中冰浴條件下勻漿，離心，取上清液，按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行腦組織AC活性、cAMP、PKA含量檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)小鼠體長(zhǎng)的影響

灌胃20d后陽(yáng)性對(duì)照組、用藥組小鼠體長(zhǎng)明顯大于空白對(duì)照組，存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組比較，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。抑制劑組與用藥組結(jié)果相當(dāng)。見(jiàn)表1。

表1 藥物對(duì)小鼠體長(zhǎng)的影響

2.2 Gi/o蛋白western blot檢測(cè)結(jié)果

小鼠腦組織Gi/o蛋白western blot結(jié)果顯示，用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組明顯比空白對(duì)照組含量高。證明藥物可以增加腦組織內(nèi)Gi/o蛋白含量。而其抑制劑組Gi/o蛋白含量并不降低，因?yàn)榈鞍滓种苿┲饕峭ㄟ^(guò)抑制其受體表達(dá)從而抑制Gi/o蛋白所影響的信號(hào)通路的。

1 2 3 4

圖1 Gi/o蛋白western blot 檢測(cè)結(jié)果

注：1.空白對(duì)照組 2. 陽(yáng)性對(duì)照組 3. 用藥組 4. Gi/o 蛋白抑制劑組

2.3 藥物對(duì)小鼠血清生長(zhǎng)激素含量的影響

由于溶血，每組8個(gè)樣本中各丟失了幾個(gè)樣本。用藥組血清生長(zhǎng)激素含量在數(shù)值上明顯高于其他組，特別是空白對(duì)照組，但差別不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 藥物對(duì)小鼠血清生長(zhǎng)激素含量的影響

2.4 藥物對(duì)小鼠腦組織AC活性、cAMP含量、PKA含量的影響

用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組腦組織AC活性明顯低于空白對(duì)照組，而Gi/o蛋白抑制劑組與空白對(duì)照組相當(dāng)，明顯高于用藥組；用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組腦組織cAMP含量均較空白對(duì)照組有所降低，存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，Gi/o蛋白抑制劑可以抑制這一現(xiàn)象，含量與空白對(duì)照組相當(dāng)；藥物引起小鼠腦組織PKA活性降低，與空白對(duì)照組比較(P<0.01)，數(shù)值上顯示用藥組PKA活性較陽(yáng)性對(duì)照組高，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而Gi/o蛋白抑制劑可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。見(jiàn)表3。

表3 藥物對(duì)小鼠腦組織AC活性、cAMP含量、PKA含量的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先驗(yàn)證了酸棗仁提取物促進(jìn)小鼠體長(zhǎng)增長(zhǎng)的作用，說(shuō)明酸棗仁提取物可以明顯增加生長(zhǎng)發(fā)育期小鼠的體長(zhǎng)。由于側(cè)腦室注射Gi/o蛋白抑制劑會(huì)引起動(dòng)物癱瘓，所以我們只是在第20天灌胃后進(jìn)行了一次側(cè)腦室注射，由于之前與用藥組一樣灌胃了20d藥物，所以體長(zhǎng)與用藥組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。用藥組血清生長(zhǎng)激素含量雖然在數(shù)值上高于其他各組，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是由于我們以往都是給藥后30min檢測(cè)血中生長(zhǎng)激素含量，而此次，我們?yōu)榱吮M快取腦組織檢測(cè)其他指標(biāo)，在給藥20min后就采血檢測(cè)了血清生長(zhǎng)激素含量，可能藥效還沒(méi)達(dá)到峰值。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)生長(zhǎng)激素含量時(shí)，因?yàn)檠劭舨裳袝r(shí)會(huì)由于血液碰到周圍毛發(fā)及胡須而溶血，故脫落了幾例數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酸棗仁提取物可以引起Gi/o蛋白高表達(dá)，降低腦組織AC活性，再引起cAMP含量下降，使得PKA含量下降，與我們前期實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)這一系列現(xiàn)象會(huì)引起腦組織5-HT1AR高表達(dá)，從而引發(fā)慢波睡眠，引起生長(zhǎng)激素含量升高最終引起動(dòng)物體長(zhǎng)增長(zhǎng)[5]。

cAMP-PKA屬細(xì)胞經(jīng)典途徑之一，其過(guò)程為G蛋白偶聯(lián)受體將信號(hào)首先傳至AC,控制cAMP的含量，PKA的活性由cAMP所決定，PKA負(fù)責(zé)受體，離子通道，轉(zhuǎn)錄因子等很多蛋白的磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生物活性反應(yīng)及平衡。G蛋白發(fā)揮主要介導(dǎo)機(jī)制的是Gα亞基，根據(jù)偶聯(lián)的性質(zhì)，可以分為Gs、Gi/o和Gq。Gs為興奮性偶聯(lián)，可以激活下游偶聯(lián)的腺苷酸環(huán)化酶(AC)，使細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP濃度升高，繼而激活PKA-CREB等通路。Gi/o為抑制性偶聯(lián)，抑制AC活性，導(dǎo)致cAMP濃度下降。Gq偶聯(lián)磷脂酶PLCβ，結(jié)果導(dǎo)致DG和IP3增多，繼而激活PKC，下游底物被磷酸化后，信號(hào)得到級(jí)聯(lián)放大。因此，我們的實(shí)驗(yàn)證明藥物引起了Gi/o蛋白的高表達(dá)，引起抑制cAMP-PKA途徑，引發(fā)覺(jué)醒減少，從而睡眠，特別是慢波睡眠增加引起動(dòng)物身高增高的，這與報(bào)道相符[6]。

由于目前沒(méi)有市售的促進(jìn)慢波睡眠的成藥和中草藥及單體成分。既往研究[7]發(fā)現(xiàn)酸棗仁皂苷A的具有促進(jìn)慢波睡眠和生長(zhǎng)激素分泌作用。文中所用藥物為酸棗仁提取物，其總皂苷含量為5%，而酸棗仁提取物中具有促進(jìn)睡眠的作用主要是皂苷A和皂苷D，而且研究表明皂苷A作用更好[8]。文中實(shí)驗(yàn)中酸棗仁提取物的用量是將酸棗仁提取物折合成酸棗仁皂苷A的含量。而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)小鼠增高作用與酸棗仁皂苷A相當(dāng)。由于提取物比單體成分價(jià)格低廉，這就大大降低了以后臨床使用的成本。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了其作用通路，為今后研究藥物通過(guò)促進(jìn)慢波睡眠促進(jìn)骨骼增高提供了研究思路，為以Gi/o蛋白、cAMP-PKA通路上如cAMP、AC、PKA為靶點(diǎn)的促進(jìn)慢波睡眠的藥物研究提供了研究基礎(chǔ)。