張 葉，余科科，邢 杰，丁聞潔，戎偉芳

惡性腫瘤嚴重危害人類健康，在我國肺癌發(fā)病率和死亡率均位居各類腫瘤之首，其中肺腺癌是肺癌中最常見的組織學類型[1]。肺葉切除是臨床治療早期肺腺癌的傳統(tǒng)方式，IA期肺腺癌通常無需術后放化療[2-3]；但即使具有相同臨床指標，患者預后也有顯著不同。課題組前期研究[4-5]顯示肺腺癌病理亞型是影響IA期肺腺癌患者的重要預后因素。

近期，GPR110多項研究被相繼報道。Lee et al[6]發(fā)現(xiàn)synaptamide是GPR110特異性配體，可觸發(fā)誘導發(fā)育神經(jīng)元神經(jīng)、突觸發(fā)生。Ma et al[7]報道：GPR110在肝細胞肝癌中高表達；敲除GPR110后削弱了肝細胞癌的發(fā)生。但GPR110在肺腺癌進展中的作用及意義尚不明確。因此，該研究將分析GPR110在IA期肺腺癌不同病理組織亞型中表達差異與預后的相關性，探索一種新的肺腺癌特異性分子標志物。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年1～12月肺腺癌石蠟標本90例，其中附壁生長型肺腺癌標本(包括原位腺癌、微浸潤性腺癌和以附壁生長為主的浸潤性腺癌)30例、以腺泡/乳頭樣為主的浸潤性腺癌標本30例、以微乳頭/實體為主的浸潤性腺癌標本30例，均取材于上海交通大學附屬胸科醫(yī)院手術切除標本，術前、術后診斷明確，所有標本均經(jīng)兩名資深病理醫(yī)生重新判讀、確認其病理組織學亞型。所有標本均為IA期肺腺癌，無遠處器官及淋巴結轉移；臨床資料完整，術前均未接受放療、化療，且無其他基礎性疾病或急慢性病。同時選取炎癥石蠟標本10例作為對照。其中男47例，女43例；年齡31～82(60.86±8.908)歲；腫塊大?。?1 cm 19例、1～2 cm 46例、>2 cm 25例，見表1。

表1 三種亞型臨床病理參數(shù)(n)

1.2 主要實驗試劑GPR110試劑：ADGRF1/GPR110 Antibody(N-Terminus) IHC-plusTM LS-A2021購自上海斯信生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1免疫組織化學 免疫組織化學操作具體步驟如下：① 切片:切3.5 m石蠟切片，70 ℃烤箱烤片1 h；② 脫蠟:石蠟切片使用EZ脫蠟液72 ℃脫蠟，沖洗液洗3次；③ 抗原修復：使用堿性細胞調節(jié)液CC1 95 ℃修復36 min，沖洗液沖洗3次；④ 一抗：36 ℃孵育32 min，沖洗液沖洗3次；⑤ 二抗：使用羅氏ultra viewDAB試劑盒，二抗36 ℃孵育8 min，DAB在36 ℃顯色8 min，沖洗液沖洗3次；⑥ 襯染:使用hematoxylin ii 36 ℃染色8 min，沖洗3次，返藍液Bluing reagent 36 ℃染色4 min，用沖洗液沖洗3次；⑦ 洗潔精水溶液浸泡免疫組化片3 min，水洗3次，表面無油漬即可；⑧ 脫水、透明，中性樹膠封片。

圖1 免疫組化法檢測GPR110在不同病理亞型肺腺癌中的表達 ×200

1.3.2捷達形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)(JEDA 801D)處理 GPR110染色定位在胞膜，陽性信號的判定標準是胞膜棕黃色或黃色染色顯現(xiàn)。在附壁生長組、腺泡/乳頭組、微乳頭/實體組的肺腺癌標本中，每組、每位患者的每張免疫組化切片，任取6個陽性區(qū)域，測量切片的平均光密度值，統(tǒng)計分析每組GPR110表達水平的高低。

1.3.3隨訪 所有患者均隨訪5年，期間無1例失訪，隨訪率達100%。通過門診定期復查或電話聯(lián)系方式隨訪患者5年生存情況。

1.4 統(tǒng)計學處理使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)中計量資料采用單因素方差分析；兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；計數(shù)資料采用卡方檢驗；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線圖，并進行Log-Rank檢驗；所有檢驗結果均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌不同組織亞型中GPR110表達水平比較在附壁生長組、腺泡/乳頭組、微乳頭/實體組的肺腺癌組織標本中GPR110的表達呈逐漸遞增趨勢，炎癥對照組未見陽性表達，見圖1，平均光密度值分別為(0.484±0.073)、(0.500±0.058)、(0.542±0.073),3種亞型平均光密度經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，后經(jīng)兩兩比較可知，附壁生長組與腺泡/乳頭組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；附壁生長組與微乳頭/實體組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；腺泡/乳頭組與微乳頭/實體組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 GPR110表達與臨床相關因素分析進一步分析3種亞型中GPR110表達差異與臨床各因素的相關性。分別檢驗3組中各因素平均光密度值可知：3種亞型肺腺癌患者性別、年齡、腫塊大小均與GPR110表達無相關性(P>0.5)(表2)。

2.3 不同組織亞型肺腺癌患者5年生存率與GPR110表達的相關性分析采用Kaplan-Meier繪制3種亞型累積生存曲線分析圖(圖2)，并進行Log-Rank檢驗，可知3種分型生存曲線比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。采用 Cox 比例風險模型分析肺腺癌患者5年生存率的可能危險因素，結果顯示：以微乳頭/實體型為參照組，附壁生長型是微乳頭/實體型發(fā)生死亡的0.014倍；腺泡/乳頭型是微乳頭/實體型發(fā)生死亡的0.103倍?；颊?年生存率與性別、年齡、分化程度、腫塊大小無相關性(P>0.05)；與組織亞型密切相關，是肺腺癌患者5年生存的危險因素(P<0.05)(表3)。

圖2 3種亞型累積生存分析

表2 3種亞型GPR110表達與臨床相關因素分析

表3 90例肺腺癌患者5年生存危險因素的COX回歸分析

3 討論

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是細胞膜上具有7次跨膜結構的受體蛋白，是人體內(nèi)最大的蛋白質家族。近40%的藥物是針對GPCR的，靶向這一完整的膜蛋白超家族成員的藥物是現(xiàn)代醫(yī)學的核心。黏附G蛋白偶聯(lián)受體(adhesion G protein-coupled receptor, aGPCR)是數(shù)目第二多的GPCR家族，因胞外含有大量黏附蛋白中的結構域而被廣泛認為和細胞運動及識別等相關，是胞內(nèi)外信號連接的橋梁。GPR110是一種孤兒G蛋白偶聯(lián)受體，屬于aGPCR子家族。已有的研究表明多種黏附G蛋白偶聯(lián)受體蛋白在腫瘤中起著重要功能。如GPR116促進乳腺癌轉移；GPR126促進結腸癌的發(fā)生和發(fā)展[8-10]。Shi et al[11]研究發(fā)現(xiàn)GPR110在膠質瘤中的表達高于正常腦組織，高表達GPR110的膠質瘤患者總體生存率較低，GPR110在不影響細胞增殖和遷移的前提下，增強了細胞的侵襲能力。

本研究檢測GPR110在IA期肺腺癌不同病理亞型，即附壁生長組、腺泡/乳頭組、微乳頭/實體組中的表達水平，結果顯示GPR110在3組中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。炎癥對照組中未見陽性表達。該結果與相關的研究[12-13]報道一致，提示GPR110可能是肺腺癌的潛在腫瘤標志物，參與了肺腺癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展及惡性進展過程。同時，經(jīng)檢驗，3種病理亞型中，性別、年齡、腫塊大小等因素中GPR110的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示GPR110的表達與性別、年齡、腫塊大小無相關性。進一步對不同病理亞型肺腺癌患者5年生存率隨訪數(shù)據(jù)進行多因素方差分析發(fā)現(xiàn)：性別、年齡、分化程度、腫塊大小等因素對患者5年生存率無影響，而病理組織亞型是影響肺腺癌患者5年生存率的危險因素(P<0.05)；GPR110表達量較高的微乳頭/實體型患者與GPR110表達量較低的附壁生長型患者相比，其累積生存時間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

綜上所述，GPR110可能是潛在的早期肺腺癌患者術后預防性治療及危險性預測的新的靶分子，通過檢測GPR110表達，可初步對早期肺腺癌患者進行篩查并可對IA期不同組織亞型肺腺癌患者的5年生存率進行預測、評估，對臨床診療具有輔助、指導作用。本研究結果顯示GPR110在IA期不同病理亞型的肺腺癌中表達差異具有統(tǒng)計學意義，表達量越高，患者預后越差，提示GPR110可能參與了不同病理亞型肺腺癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并對預后產(chǎn)生影響。但由于研究樣本量較小，還需進一步擴大樣本量加以驗證；同時，因無法定量分析，目前還不能成為提示早期肺腺癌預后的預測指標。另據(jù)報道[13]稱，GPR110分子結構中有兩個蛋白結構域可以發(fā)生剪切，剪切產(chǎn)物進入血液循環(huán)可以被檢測到，因此這也是未來的可能研究方向。綜上，根據(jù)本研究結果，GPR110可能參與肺腺癌發(fā)生發(fā)展進程，但其參與的分子機制尚不明確，仍需進一步的深入研究。