王禮賢，胡月陽

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT)是一種常見的婦科病，臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、不孕和盆腔包塊等，在育齡期女性中發(fā)病率為10%～15%，且呈逐年上升趨勢，由于缺乏特異性的診斷標(biāo)志物，確診時間平均延遲6～7年[1]。腹腔鏡檢查雖為診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其為有創(chuàng)性檢查且費用昂貴并不能被患者廣泛接受，因此，尋找特異性強和敏感性高的非侵入性診斷標(biāo)記物在EMT的研究中尤為重要。近年來，有研究認(rèn)為微小RNA(microRNA，miRNA)具備成為許多疾病潛在生物標(biāo)志物的可能性[2]。在此之前作者已對EMT患者和正常對照女性子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的外泌體源性miRNA進行芯片分析。以此為基礎(chǔ)，該研究擬采用RT-qPCR技術(shù)檢測EMT患者與正常對照女性血漿外泌體源性miRNA-188-5p與miRNA-4741的表達(dá)水平，并通過ROC曲線分析二者在EMT中診斷價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2017年1月～2018年4月就診于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科的經(jīng)病理確診為EMT的患者50例，年齡26～39(32.71±5.60)歲，取其血漿標(biāo)本為病例組；另選取同時期健康體檢無異常的育齡期婦女50例，年齡28～38(33.68±4.22)歲，取其血漿標(biāo)本為對照組；所有入組者既往月經(jīng)規(guī)律，3個月內(nèi)未服用過激素類藥物，亦無其他身體疾病。所有參與者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集和外泌體提取 使用含EDTA-K2的真空采血管收集全部受試者的血液標(biāo)本，離心5 min (3 000 r/min)分離血漿，使用外泌體提取試劑盒(美國Invitrogen公司)提取血漿標(biāo)本中的外泌體；使用miRcute親和柱(北京天根生化科技公司)提取和純化外泌體內(nèi)的miRNA，上述操作嚴(yán)格按說明書操作。將純化好的miRNA溶解于RNase-Free dd H2O 10 μl(北京天根生化科技公司)，保存于液氮中供試驗用。

1.2.2實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR) 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國promega公司)對提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄呈cDNA。反應(yīng)條件為：37 ℃、60 min，65 ℃、5 s。PCR反應(yīng)體系為：5 μl SYBR green MIX(日本Takara公司)，5 μl cDNA，去RNA水3 μl，靶基因上、下游引物各1 μl。反應(yīng)程序：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，72 ℃、10 s；共40個循環(huán)。儀器采用Prism7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物詳見表1。每份標(biāo)本設(shè)置3個復(fù)孔。以內(nèi)參U6為miRNA相對定量參照基因。對每個檢測目標(biāo)基因設(shè)定相同的循環(huán)閾值(cycle threshold，CT值)極限和截點。計算miRNA表達(dá)量計算公式：2-ΔΔCT來比較組間差異，其中ΔCT=CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)。

表1 RT-qPCR的引物序列

1.2.3PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 電泳設(shè)備：電泳儀和電泳槽(北京市六一儀器廠)。采用2 g瓊脂糖(西班牙進口分裝)、1×TAE緩沖液100 ml 和EB溶液(北京鼎盛生物技術(shù)公司)7 μl制備1.5%瓊脂糖凝膠。電泳槽內(nèi)加入1×TAE電泳液600 ml。加樣，DNA Marker，樣品5 μl，設(shè)置空白對照GAPDH。電壓120 V，電流60 mA，電泳20 min，然后凝膠成像儀(英國Syngene公司)下成像，攝影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理根據(jù)前期芯片結(jié)果，采用R2.15.0軟件，對兩組外泌體源性miRNA-188-5p與miRNA-4741表達(dá)水平進行聚類分析。采用SPSS 21.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)來表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，截斷值的確定采用受試者工作曲線(receiver operator characteristic curve, ROC曲線)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般資料比較病例組和對照組年齡、初潮年齡、月經(jīng)周期、胎產(chǎn)次和體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 病例組與對照組研究對象的一般特征

2.2 外泌體源性miRNA-188-5p與miRNA-4741的表達(dá)差異首先，根據(jù)前期芯片結(jié)果，采用R2.15.0軟件，對兩組中外泌體源性miRNA-188-5p與miRNA-4741的表達(dá)水平進行聚類分析，見圖1A。如圖所示，列表示組織樣本，行表示表達(dá)水平，用紅色和綠色分別表示高表達(dá)和低表達(dá)，黑色介于二者之間。根據(jù)組織樣本類別不同自動發(fā)生聚集，10個樣本自然分為兩組，E1-5代表病例組，N1-5代表對照組，組內(nèi)5個樣本一致性較高，從圖中可看出miRNA-188-5p與miRNA-4741表達(dá)水平在兩組間比較差異較大：病例組中大部分呈現(xiàn)綠色，即表達(dá)降低；對照組中大部分呈現(xiàn)紅色，即表達(dá)升高。其次，采用RT-PCR技術(shù)檢測病例組和對照組中miRNA-188-5p與miRNA-4741表達(dá)水平，見圖1B。如圖所示，E1-3代表病例組，N1-3代表對照組，病例組中miRNA-188-5p與miRNA-4741表達(dá)水平較對照組低。

圖1 兩組中血漿外泌體源性miRNA-188-5p與miR-4741表達(dá)差異

2.3 外泌體的形態(tài)學(xué)特點采用外泌體提取試劑盒提取出外泌體后，用PBS稀釋，經(jīng)負(fù)染后于透射電鏡下觀察，可見大小不均一的圓形或類圓形透亮區(qū)，此為囊泡狀的外泌體，其外層為脂質(zhì)包裹，直徑在30～200 nm之間(圖2)。

圖2 透射電鏡下血漿外泌體的形態(tài)

2.4 兩組血漿外泌體源性miRNA-188-5p與miRNA-4741表達(dá)的比較采用RT-qPCR技術(shù)檢測兩組血漿中外泌體miRNA-188-5p與miRNA-4741表達(dá)水平。與對照組中miRNA-188-5p的表達(dá)水平0.537(0.463～0.609)相比，病例組中miRNA-188-5p的表達(dá)水平0.023(0.010～0.029)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組中miRNA-4741的表達(dá)水平0.628(0.537～0.714)相比，病例組中miRNA-4741的表達(dá)水平0.047(0.015～0.089)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 血漿外泌體源性miRNA-188-5p與miRNA-4741在EMT中的診斷價值通過ROC曲線分析，結(jié)果顯示血漿外泌體源性miRNA-188-5p診斷EMT的截斷值為0.025，曲線下面積(area under curve，AUC)為0.875(95% CI：0.746～0.933)，敏感性度77.6%，特異度為83.5%；血漿外泌體源性miRNA-4741診斷EMT的截斷值為0.056，AUC為0.907(95%CI：0.824～0.961)，敏感度為84.5%，特異性度91.2%；二者聯(lián)和診斷EMT的截斷值為0.047，AUC為0.916(95%CI：0.835～0.963)，敏感度為87.1%，特異性度93.8%，見圖3和表3。

圖3 血漿外泌體miRNA-188-5p與miRNA-4741診斷EMT的ROC曲線

表3 血漿外泌體miRNA-188-5p與miR-4741診斷EMT的ROC曲線參數(shù)

3 討論

近年來，許多研究認(rèn)為miRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、分化和凋亡以及細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)，參與調(diào)節(jié)EMT的促進經(jīng)血逆流、炎癥發(fā)生和血管生成等多種病理過程，多種循環(huán)miRNA被認(rèn)為具有EMT組織特異性[3-4]。Hunter et al[5]發(fā)現(xiàn)血漿中miRNA主要來源于外泌體，外泌體源性miRNA因受外泌體雙層膜結(jié)構(gòu)的保護，使其免受RNA酶的降解，具有較好的穩(wěn)定性，提高其作為疾病生物標(biāo)志物的潛力。許多研究[6]表明外泌體源性miRNA與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，例如卵巢腫瘤、肺腺癌和乳腺癌等。EMT雖為一種良性疾病，卻具有侵襲、復(fù)發(fā)等惡性腫瘤的生物學(xué)行為。并且，外泌體在血漿中具有很高的濃度，且血漿樣本具有采集容易、可重復(fù)獲得以及對患者創(chuàng)傷小的特點，因此，血漿外泌體源性miRNA具備了成為EMT的非侵入性生物標(biāo)志物的條件[1]。

國內(nèi)外對于EMT中外泌體和外泌體源性miRNA的研究報道甚少，目前尚處于起步階段，本研究是國內(nèi)首次對EMT患者血漿外泌體源性miRNA-188-5p與miRNA-4741表達(dá)水平進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，病例組中二者的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，此結(jié)果也與我們前期芯片結(jié)果一致，驗證了芯片結(jié)果的真實性和可靠性。目前，國內(nèi)外學(xué)者對于miRNA-188-5p與miR-4741的研究也較少，Li et al[7]發(fā)現(xiàn)miR-188-5p作為抑癌基因，在膠質(zhì)瘤中miRNA-188-5p過表達(dá)，可以抑制β-catenin表達(dá)，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換，起到促進細(xì)胞凋亡的作用。雖然到目前為止EMT的發(fā)病機制尚不清楚，但很多研究[8]表明EMT患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖率增加，凋亡率減少。因此，推測在EMT患者中miRNA-188-5p表達(dá)水平降低，可能通過促進內(nèi)膜細(xì)胞的增殖，減少內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡，從而在EMT的發(fā)生中發(fā)揮了一定的作用。對于miR-4741的研究，Liu et al[9]在尋找預(yù)測肝細(xì)胞癌肝動脈栓塞術(shù)預(yù)后的生物標(biāo)志物的研究中，首先采用miRNA Profiling Chips篩選出包含miR-4741在內(nèi)的19個差異表達(dá)miRNA，隨后采用RT-qPCR技術(shù)檢測miR-4741表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其存在差異表達(dá)，到目前為止雖還未發(fā)現(xiàn)其具體功能，但研究認(rèn)為血液循環(huán)中miR-4741作為可以預(yù)測肝細(xì)胞癌肝動脈栓塞術(shù)預(yù)后的一個候選生物標(biāo)志物。就本研究而言，在前期采用芯片技術(shù)，篩選出與正常女性相比，EMT中多個具有差異表達(dá)的外泌體源性miRNA，再采用RT-qPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)病例組中miR-4741 表達(dá)低于對照組，從而推測血漿外泌體源性miRNA-4741可以作為檢測卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的一個生物標(biāo)志物。

目前，臨床上對于EMT的術(shù)前診斷主要依靠超聲和血清糖類抗原125(cancer antigen-125,CA125)檢查，超聲檢查對于早期、不典型和特殊部位的EMT診斷率并不高，存在一定的局限性；而血清CA125是糖蛋白性的腫瘤相關(guān)抗原，雖然作為診斷EMT常規(guī)的實驗室檢查已在臨床上應(yīng)用多年，但其靈敏度和特異度并不是特別高，發(fā)生卵巢癌或上皮性腫瘤時CA125也會升高。周贊華 等[10]認(rèn)為CA125診斷EMT的敏感度為74.4%，特異度為72.7%；湯禮賓 等[11]認(rèn)為CA125診斷EMT的敏感度為66.3%，特異度為85.5%。而本研究顯示血漿外泌體源性miRNA-188-5p、miRNA-4741以及二者聯(lián)合起來診斷EMT的敏感度分別為77.6%、84.5%和87.1%，特異度分別為83.5%、91.2%和93.8%，與血清CA125相比具有較高的診斷效能。綜上，血漿外泌體源性miRNA-188-5p與miRNA-4741可作為診斷EMT潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，為今后EMT非創(chuàng)傷性檢查的生物標(biāo)志物的尋找和鑒定提供了新方向。