姚國敏，古麗努爾·買買提，李 蓉，鄧 穎，焦 聰

0引言

視網(wǎng)膜屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是人體內(nèi)最具代謝活性的組織之一[1]。視網(wǎng)膜的高能量需求是由于它是一個將光能轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元信號的高度敏感和高效的系統(tǒng)，這也是視網(wǎng)膜比其他組織更快消耗氧氣的原因[2]。因此，在能量需求增加的時候，氧氣成為視網(wǎng)膜中最有限的代謝物之一。視網(wǎng)膜對缺氧很敏感，在多種視網(wǎng)膜疾病中，缺氧和/或缺血扮演了重要的病因?qū)W角色，如視網(wǎng)膜血管阻塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性或高海拔視網(wǎng)膜病變[3]。氧化應(yīng)激是指活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生與內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)清除活性氧的能力之間的不平衡。自由基和活性氧通過氧化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸而對細胞膜、DNA和其他細胞結(jié)構(gòu)造成不可逆損傷，引起細胞凋亡或細胞死亡，并由大分子損傷引起細胞變性和神經(jīng)變性[4]。研究證實，缺氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激在缺血性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機制中起重要作用[5]。

脂聯(lián)素是由脂肪細胞分泌的一種內(nèi)源性生物活力蛋白質(zhì)，也是分泌最多的脂肪因子。研究表明，脂聯(lián)素具有改善機體胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、重塑受損血管和抑制動脈粥樣硬化保護心血管系統(tǒng)、抗氧化應(yīng)激及抗炎等多種生理功能[6]。脂聯(lián)素及其受體在人眼組織中廣泛表達，在視網(wǎng)膜中可以檢測到脂聯(lián)素的表達，而脂聯(lián)素受體位于不同的視網(wǎng)膜細胞中[7]。越來越多的證據(jù)表明，脂聯(lián)素通過與受體結(jié)合發(fā)揮作用，激活下游分子通路，在多種疾病中具有神經(jīng)保護作用[7]。缺乏脂聯(lián)素可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管，而脂聯(lián)素通路的激活可能恢復(fù)能量代謝，從而抑制視網(wǎng)膜病變代償性的病理性新生血管形成[8]。既往研究顯示，脂聯(lián)素可減輕小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中視網(wǎng)膜無血管區(qū)面積的形成和病理性新生血管的生成，但對于其具體機制尚不完全明確[9]?；诖耍覀円院愫雍锩}絡(luò)膜/視網(wǎng)膜內(nèi)皮(RF/6A)細胞為研究對象，進一步觀察脂聯(lián)素對缺氧條件下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞活性和凋亡的影響并探討其具體機制。

1材料和方法

1.1材料恒河猴RF/6A細胞系(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)。主要試劑：重組人脂聯(lián)素(美國BioVision公司);噻唑藍(MTT)試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；ROS檢測試劑盒-DCFH-DA(西安科昊生物科技有限公司)；兔單抗Bax、兔單抗Bcl-2(美國 Cell signaling 公司)。主要儀器設(shè)備：全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo scientific公司，Multiskan MK3型)；激光共聚焦熒光顯微鏡(日本Nikon公司，C2型)；熒光酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司，ELX800型)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將RF/6A細胞置于37℃、體積分數(shù)5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，在含有胎牛血清(體積分數(shù)10%)和抗生素的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

1.2.2實驗分組及模型建立將細胞按照隨機對照原則分為五組，對照組(加入PBS液)、缺氧損傷組、缺氧損傷+脂聯(lián)素組(按照脂聯(lián)素濃度分為5、50、100μmol/L三組)，用以選擇合適的脂聯(lián)素作用濃度進行后續(xù)研究。然后將細胞按照隨機對照原則分為三組，對照組(加入PBS液)、缺氧損傷組、缺氧損傷+脂聯(lián)素(50μmol/L)組。缺氧模型的建立參照文獻[10]的方法，細胞接種24h后，對照組換新鮮培養(yǎng)液，缺氧損傷組換CoCl2(作用濃度125μmol/L)工作液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。脂聯(lián)素處理組在細胞接種24h后，構(gòu)建缺氧模型前加入相應(yīng)濃度的脂聯(lián)素作用6h。

1.2.3細胞活力檢測采用MTT法檢測細胞活力。取對數(shù)生長期細胞，棄上清液，用胰蛋白酶消化后，加入含體積分數(shù)10%的DMEM培養(yǎng)液，制成細胞濃度為5×104個/mL的細胞懸液。取200μL 接種于96孔板，培養(yǎng)板置于37℃、體積分數(shù)5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24h，棄去原培養(yǎng)液，按上述方法分為5組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，在完成培養(yǎng)后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，棄去各孔培養(yǎng)液，每孔加入200μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解。用自動酶標(biāo)儀在490nm波長處測定每孔的吸光度值(optical density，OD)。每組重復(fù)檢測3次。細胞活力(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.2.4 Bax、Bcl-2蛋白表達檢測采用Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白的表達。各組 RF/6A細胞用PBS清洗后進行細胞裂解，提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE分析，半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF膜，用50g/L脫脂牛奶室溫封閉1h。分別加入稀釋的兔抗Bax、Bcl-2抗體及β-actin抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜。次日，TBST 洗膜10min×3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2000)，室溫孵育1h；TBST 洗10min×3次，后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在Tanon凝膠圖像處理系統(tǒng)顯影，計算Bax和Bcl-2的相對蛋白表達。

1.2.5細胞內(nèi)ROS的檢測各組細胞以每孔1×106個接種于6孔板，處理結(jié)束后，加入DCFH-DA探針(10μmol/L)孵育90min，用PBS漂洗2次，然后用溫?zé)o血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30min，置于熒光顯微鏡下觀察拍照，熒光酶標(biāo)儀讀取各組熒光強度。

統(tǒng)計學(xué)分析：實驗結(jié)果采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度脂聯(lián)素對缺氧損傷RF/6A細胞活力的影響MTT結(jié)果顯示，對照組、缺氧損傷組、缺氧損傷+5μmol/L脂聯(lián)素組、缺氧損傷+50μmol/L脂聯(lián)素組、缺氧損傷+100μmol/L脂聯(lián)素組的細胞活力分別為100.05%±3.34%、54.28%±4.16%、63.65%±2.95%、78.00%±5.10%、75.48%±6.56%，五組之間細胞活力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.03，P<0.001)。與對照組相比，缺氧損傷組和缺氧損傷+脂聯(lián)素(5、50、100μmol/L)組細胞活力均下降(t=14.85、14.13、6.26、5.78，均P<0.01)。與缺氧損傷組相比，缺氧損傷+脂聯(lián)素(5、50、100μmol/L)組細胞活力均顯著增加(t=-3.18、-6.24、-4.73，均P<0.05)，提示脂聯(lián)素對缺氧損傷的RF/6A細胞存活具有促進作用。與缺氧損傷+5μmol/L脂聯(lián)素組相比，50、100μmol/L脂聯(lián)素組細胞活力均增加(t=-4.21、-2.84，均P<0.05)，但50μmol/L較100μmol/L脂聯(lián)素預(yù)處理的細胞活力無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.52，P>0.05)，提示50μmol/L脂聯(lián)素是較為合適的保護作用濃度(圖1)。因此，本研究選擇后續(xù)實驗中脂聯(lián)素的作用濃度為50μmol/L。

圖1 各組RF/6A細胞活力比較

2.2脂聯(lián)素對缺氧損傷的RF/6A細胞凋亡蛋白表達的影響Western blot結(jié)果顯示，對照組、缺氧損傷組、缺氧損傷+脂聯(lián)素組細胞凋亡蛋白Bax相對表達水平分別為0.21±0.04、0.79±0.03、0.38±0.04；Bcl-2相對表達水平分別為0.17±0.04、0.42±0.03、0.81±0.03；Bcl-2/Bax分別為0.84±0.04、0.53±0.03、2.11±0.14。三組之間Bcl-2/Bax比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=294.80，P<0.001)。與對照組相比，缺氧損傷組細胞Bcl-2/Bax表達下調(diào)(t=11.56，P<0.001)，缺氧損傷+脂聯(lián)素組細胞Bcl-2/Bax表達上調(diào)(t=-15.32，P<0.001)；與缺氧損傷組相比，缺氧損傷+脂聯(lián)素組細胞Bcl-2/Bax表達上調(diào)(t=-19.34，P<0.001，圖2)。

圖2 各組RF/6A細胞表達Bax及Bcl-2蛋白條帶及統(tǒng)計學(xué)比較

2.3脂聯(lián)素對缺氧損傷的RF/6A細胞內(nèi)ROS水平的影響熒光染色結(jié)果顯示，對照組細胞在熒光顯微鏡下可見微弱熒光；而CoCl2誘導(dǎo)缺氧后細胞內(nèi)可見到較強的熒光，說明缺氧損傷可使RF/6A細胞內(nèi)ROS生成增多，引起細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)；但使用脂聯(lián)素預(yù)處理后RF/6A細胞內(nèi)的熒光強度較缺氧損傷組明顯減弱，說明脂聯(lián)素可減少CoCl2誘導(dǎo)的缺氧損傷后細胞內(nèi)的ROS生成。統(tǒng)計分析顯示，對照組、缺氧損傷組、缺氧損傷+脂聯(lián)素組細胞的ROS水平依次為10.00±1.00、245.98±23.52、108.23±9.51，三組細胞中的ROS水平比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=196.23，P<0.001)。與對照組相比，缺氧損傷組和缺氧損傷組+脂聯(lián)素組細胞內(nèi)ROS水平明顯升高(t=-17.37、-17.79，均P<0.001)；與缺氧損傷組相比，缺氧損傷+脂聯(lián)素組細胞內(nèi)的ROS水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.41，P<0.01，圖3)。

圖3 RF/6A細胞內(nèi)ROS生成的熒光圖像(×200)及統(tǒng)計學(xué)比較

3討論

缺血性視網(wǎng)膜病變是一類臨床常見、波及年齡范圍較為廣泛的復(fù)雜眼病，病理機制受到多種細胞因子、細胞外基質(zhì)成分及信號網(wǎng)絡(luò)等的緊密調(diào)控和相互作用[11]。雖然在防治方面取得了一些進展，但此類疾病多進展迅速，部分患者治療效果并不理想，則很快進展到增殖期，帶來嚴(yán)重的視力損害，因此研究這些視網(wǎng)膜病變發(fā)生進展的機制、找尋新的治療靶點至關(guān)重要[12]。多種原因可導(dǎo)致局部視網(wǎng)膜缺血缺氧，激活缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路，從而導(dǎo)致病理性新生血管的形成[13]。近年來內(nèi)源性脂肪因子與多種疾病發(fā)生的密切關(guān)系備受關(guān)注，其中脂聯(lián)素的保護作用也成為研究熱點[6-8]。鑒于此，我們的前期研究利用動物模型觀察了脂聯(lián)素對病理性視網(wǎng)膜新生血管形成的作用。結(jié)果顯示，在小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中，外源性脂聯(lián)素可以明顯減輕視網(wǎng)膜血管損傷，從而減少視網(wǎng)膜無灌注區(qū)，進而減少繼發(fā)性病理性新生血管，證實脂聯(lián)素對視網(wǎng)膜新生血管具有抑制作用[9]。缺血、缺氧是氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變成膜的關(guān)鍵機制，因此本研究進一步觀察了脂聯(lián)素對缺氧應(yīng)激條件下視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞是否具有保護作用。在本實驗中，通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)CoCl2誘導(dǎo)的缺氧可明顯抑制RF/6A細胞的活力，與既往研究結(jié)果一致[10]。不同濃度的脂聯(lián)素預(yù)處理后可減輕CoCl2誘導(dǎo)的缺氧對RF/6A細胞的損傷，以50μmol/L濃度的保護作用最為顯著，這與我們在高糖誘導(dǎo)的RF/6A細胞損傷中觀察到的結(jié)果相似[14-15]，提示脂聯(lián)素對應(yīng)激條件下的RF/6A細胞具有保護作用，以利于維持細胞正常的生理功能。

視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞是許多眼病中重要的細胞類型之一，它由視網(wǎng)膜血管的微血管內(nèi)膜組成，廣泛分布于外叢狀層和神經(jīng)節(jié)細胞層。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的缺失是多種視網(wǎng)膜病變增殖前的損傷形式。多種應(yīng)激因素包括缺氧、高糖等可引起視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞凋亡，進而參與多種缺血性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生[16]。為了進一步了解脂聯(lián)素對缺氧損傷的RF/6A細胞凋亡的影響，本研究利用Western blot技術(shù)對細胞中促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2進行了檢測。Bax和Bcl-2是近年來Bcl-2蛋白家族研究中最具有代表性的促凋亡因子及抗凋亡因子。正常生理情況下，兩者以Bax/Bcl-2異源二聚體形式存在。當(dāng)細胞中Bax表達增多時，Bax蛋白之間相互作用形成同源二聚體，激活Caspase家族，從而促進細胞凋亡。當(dāng)細胞中Bcl-2表達上調(diào)時，則促使Bax/Bax二聚體解離，生成Bax/Bcl-2二聚體增多，抑制細胞凋亡。Bcl-2/Bax比值決定著細胞凋亡的走向，Bcl-2/Bax比值上調(diào)，抑制細胞凋亡；Bcl-2/Bax比值下調(diào)，促進細胞凋亡[17-18]。本研究中，Western blot結(jié)果提示，缺氧損傷組RF/6A細胞的凋亡蛋白Bax和Bcl-2蛋白表達均較對照組明顯上調(diào)，而Bcl-2/Bax比值明顯下調(diào)，提示在缺氧條件下，細胞凋亡信號通路被激活，以促凋亡為主；脂聯(lián)素預(yù)處理后凋亡蛋白Bax表達明顯下調(diào)，Bcl-2蛋白表達明顯上調(diào)，而Bcl-2/Bax比值顯著上調(diào)，提示脂聯(lián)素可抑制RF/6A細胞凋亡。以上結(jié)果與在高糖條件下觀察到的脂聯(lián)素抗凋亡效應(yīng)一致[14]，提示脂聯(lián)素可抑制缺氧等應(yīng)激損傷造成的細胞凋亡，從而發(fā)揮保護細胞存活的作用。

在視網(wǎng)膜缺血等病理條件下，內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生ROS和清除ROS能力之間的不平衡被擴大。氧化應(yīng)激是缺血性視網(wǎng)膜病變的病理進程中視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷的重要機制之一，局部視網(wǎng)膜缺血缺氧可誘發(fā)過量的活性氧族/活性氮族(ROS/RNS)產(chǎn)生，進而觸發(fā)多種氧化應(yīng)激信號通路，影響細胞內(nèi)的DNA和脂質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞凋亡，直接對視網(wǎng)膜血管造成損傷[4,19-20]。既往動物研究顯示，在小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中，外源性脂聯(lián)素可激活內(nèi)源性一氧化氮合酶(eNOS)促進生理性一氧化氮(NO)生成，同時又能抑制ROS/RNS的產(chǎn)生，從而減輕視網(wǎng)膜血管損傷[9]。為了進一步研究脂聯(lián)素對缺氧損傷的RF/6A細胞發(fā)揮保護作用的分子機制，本研究觀察了脂聯(lián)素對細胞中氧化應(yīng)激重要指標(biāo)ROS表達水平的影響。我們發(fā)現(xiàn)，CoCl2誘導(dǎo)的缺氧可導(dǎo)致RF/6A細胞中ROS生成明顯增多，出現(xiàn)了明顯的氧化應(yīng)激表現(xiàn)，而脂聯(lián)素預(yù)處理的RF/6A細胞中ROS生成明顯降低，提示脂聯(lián)素可抑制缺氧誘發(fā)的RF/6A細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。與在其他組織細胞中的研究相似，脂聯(lián)素可抑制氧自由基的形成，減輕缺氧/缺血狀態(tài)下心血管內(nèi)皮細胞及神經(jīng)元的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而保護這些細胞免受缺血性損傷[21]。

近年來，隨著對內(nèi)源性脂肪因子功能的關(guān)注，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可對人體起保護作用，但對其在視網(wǎng)膜疾病中的作用還有待研究。本研究證實，在視網(wǎng)膜缺氧模型中，脂聯(lián)素可通過抑制ROS的形成，減輕缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時脂聯(lián)素能促進細胞活力，抑制細胞凋亡，提示脂聯(lián)素的血管內(nèi)皮細胞保護作用機制可能與其減輕氧化應(yīng)激有關(guān)，但二者之間是否為直接關(guān)系還需要進一步驗證?？傊骄恐?lián)素對缺氧損傷下的視網(wǎng)膜血管保護作用，不僅有助于進一步闡明缺血性視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制，也對尋找和調(diào)動內(nèi)源性保護方法，減輕視網(wǎng)膜血管病變程度并改善疾病預(yù)后具有重要臨床意義。