張鳳久,張麗敏,王宏杰,李海波,王海明,彭向東,楊建玲
在臨床中,糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是致盲的主要疾病[1]。為此,研究DR的發(fā)病機(jī)制、預(yù)后治療手段等,成為臨床普遍關(guān)注的重點。該疾病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,影響因素較多?,F(xiàn)階段,在醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展的新形勢下,細(xì)胞學(xué)分析疾病的發(fā)病機(jī)制,已成為臨床研究熱點[2-3]。光生物調(diào)節(jié)作用,借助低強(qiáng)度淡色光、激光等,對組織或是細(xì)胞具有非損傷的調(diào)節(jié)性作用。目前發(fā)光二極管(light emitting diode,LED)作為一種新型光源在醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用迅速發(fā)展,一定功率和能量密度的LED照射能激活靶細(xì)胞,發(fā)揮與相干光源類似的生物學(xué)效應(yīng)。基于此,本研究為了明確LED對大鼠高糖視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的光生物調(diào)節(jié)作用,加以探究。
1.1材料
1.1.1細(xì)胞來源原代大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(美國Angio-proteomie公司)購自博士德生物科技有限公司。
1.1.2主要試劑及儀器胎牛血清、D-Hanks液、胰蛋白酶、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體、兔抗大鼠p-Akt單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(美國Sigma公司)及其相關(guān)配套試劑、細(xì)胞凋亡試劑盒及其相關(guān)配套試劑、流式細(xì)胞儀、激光掃描共焦顯微鏡(美國DB公司)。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組原代大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48h后傳代培養(yǎng),以5×105/mL的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)時間為24h,細(xì)胞貼壁后使用無血清培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h。根據(jù)實驗方案分組:正常對照組、高糖模型組、發(fā)光二極管照射高糖組。各組均避光靜置于培養(yǎng)箱內(nèi)。高糖細(xì)胞模型組培養(yǎng)基葡萄糖濃度及干預(yù)時間采用我們前期研究的結(jié)果:25mmol/L葡萄糖濃度干預(yù)48h[4]。
1.2.2發(fā)光二極管照射本組的細(xì)胞在造模48h后開始照射。將細(xì)胞放置于培養(yǎng)箱中,采用發(fā)光二極管紅光光源對培養(yǎng)箱中的細(xì)胞進(jìn)行照射,參照相關(guān)文獻(xiàn)[5]具體照射的參數(shù)值為最大功率1W,光源波長600nm,中心光功率密度6.52mW/cm2。光源與細(xì)胞要距離至少超過2cm,光斑的直徑為2.0cm,連續(xù)照射時間為350s,12h后再次照射,共計照射次數(shù)為3次。
1.2.3 MTT細(xì)胞凋亡實驗檢測各組細(xì)胞凋亡率將細(xì)胞制成5×105個/mL細(xì)胞懸液,按照100μL/孔接種至96孔板,按細(xì)胞分組處理各孔細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)2~6h,直至細(xì)胞完全貼附。按體積分?jǐn)?shù)10%的比例加入MTT工作液,37℃孵育2h,將板中培養(yǎng)基倒掉,每孔加入200μL DMSO,酶標(biāo)儀檢測490nm波長下吸光度(A490)值,每組設(shè)6個復(fù)孔,重復(fù)測量3次,取平均值。
1.2.4激光共聚焦顯微鏡觀察視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化Fluo-4/AM負(fù)載入細(xì)胞:取出培養(yǎng)4d的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞,激光共聚焦培養(yǎng)皿皿底及周圍用DMEM培養(yǎng)液潤洗3~4次,滴加Fluo-4/AM(5μmol/L)與0.02%Pluronic F127的混合溶液。細(xì)胞置于37℃恒溫培養(yǎng),避光,孵育30min;取出后加入少量DMEM培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞;用激光共聚焦顯微鏡對鈣離子進(jìn)行實時檢測。其方法為:用不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基洗滌3次,每次3min后,繼續(xù)穩(wěn)定20min;檢測熒光強(qiáng)度,設(shè)置激發(fā)波長488nm,綠色熒光接收通道BP:500~550nm,紅色熒光接收通道LP>580nm。
1.2.5 Western blot法檢測各組磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶(P-AKT)蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞,采用蛋白裂解液冰上振蕩裂解20min。4℃條件下,12000r/min離心15min,收集上清液,采用BCA蛋白定量法測量蛋白質(zhì)量濃度。按比例加入1/4體積的4倍上樣緩沖液,100℃煮沸5min進(jìn)行變性,4℃條件下,12000r/min離心5min,取上清。按每孔20μg蛋白上樣量,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行電泳分離,再用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% BSA封閉后,孵育一抗和相應(yīng)二抗,其中一抗稀釋倍數(shù)均為1∶1000,二抗稀釋倍數(shù)為1∶5000;之后用ECL發(fā)光液及顯影液定影液進(jìn)行蛋白的顯影定影,最終膠片讀取數(shù)據(jù),用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。以β-actin為內(nèi)參照,計算各目的蛋白相對表達(dá)水平,并計算Akt磷酸化比率。每個樣本設(shè)置6個復(fù)孔,同一樣本重復(fù)測量3次,取平均值。
2.1 LED照射對細(xì)胞凋亡的影響三組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.891,P<0.01)。正常對照組的細(xì)胞凋亡率顯著低于高糖模型組、發(fā)光二極管照射組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.063,P<0.01;t=10.099,P<0.01);發(fā)光二極管照射組的細(xì)胞凋亡率顯著低于高糖模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.715,P<0.01),見表1。
2.2 LED照射對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響正常對照組中細(xì)胞質(zhì)微弱Ca2+熒光染色,呈綠色熒光,細(xì)胞核為藍(lán)色熒光;高糖模型組中,細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)較強(qiáng)烈的綠色熒光;發(fā)光二極管照射組中,綠色熒光明顯的高于正常對照組,但明顯低于高糖模型組,見圖1,經(jīng)熒光像素分析三組間細(xì)胞中內(nèi)Ca2+熒光像素值具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.846,P<0.05)。正常對照組的Ca2+熒光像素值顯著低于高糖模型組、發(fā)光二極管照射組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.577,P<0.01;t=7.900,P<0.01);且發(fā)光二極管照射組內(nèi)Ca2+熒光像素值顯著低于高糖模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.881,P<0.01),見表1。
圖1 LED照射對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響(×400)
2.3 LED照射對細(xì)胞中P-AKT蛋白表達(dá)的影響三組細(xì)胞中P-AKT蛋白表達(dá)明顯不同,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.694,P<0.01)。正常對照組的P-AKT蛋白表達(dá)高于高糖模型組、發(fā)光二極管照射組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.114,P<0.01;t=2.773,P=0.014);發(fā)光二極管照射組的P-AKT蛋白表達(dá)高于高糖模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.807,P<0.01),見表1。
表1 三組間細(xì)胞凋亡率和Ca2+濃度變化及P-AKT蛋白表達(dá)量比較
高血糖是DM最基本的病理生理狀態(tài),在DM血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。高血糖導(dǎo)致的血管滲透性增加,炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞損傷是DR發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。在DM的進(jìn)展過程中,高血糖導(dǎo)致慢性微血管損傷,使得約1/10的患者出現(xiàn)增生性DR(proliferative DR, PDR)或糖尿病性黃斑水腫,嚴(yán)重威脅患者視力[6]。但針對DR目前仍缺乏有效的治療方法或藥物。通過現(xiàn)階段臨床研究發(fā)現(xiàn)發(fā)光二極管照射方式對一些組織細(xì)胞的光生物調(diào)節(jié)作用較為明顯[7-8]。為此,本研究重點分析了發(fā)光二極管的價值。
在本次研究中,通過分析發(fā)光二極管照射對大鼠高糖視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的光生物調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制,發(fā)現(xiàn)上述照射方式,對光生物調(diào)節(jié)的作用較為顯著。通過對本次研究結(jié)果的分析,發(fā)現(xiàn)以模擬的方式,對體外與體內(nèi)高血糖狀態(tài)加以評估,能夠了解到在25mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)基下,可實現(xiàn)對抗凋亡P-AKT蛋白通路的抑制,且對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生較大的影響。一般來說,細(xì)胞在人體可能會出現(xiàn)鈣超載情況,此種現(xiàn)象會導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常[9-10]。多種細(xì)胞的生存、凋亡信號,主要是利用P-AKT蛋白信號途徑的抑制進(jìn)行傳導(dǎo)的。P-AKT蛋白參與到調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂活動、分化活動或是凋亡活動中。蘇氨酸激酶是磷酸化絲氨酸的下游靶蛋白,多種細(xì)胞因子能夠與受體相結(jié)合,產(chǎn)生P-AKT蛋白亞單位,從而實現(xiàn)對蘇氨酸激酶活化的誘導(dǎo)。在維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)、功能過程中,鈣起到了十分重要的作用。在正常狀態(tài)時,細(xì)胞借助系列性的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,可保障患者體內(nèi)低鈣情況。而多種外在因素的影響致使鈣失衡,對細(xì)胞膜與線粒體造成的響應(yīng)損傷等,均會在一定程度上加快細(xì)胞的不可逆性死亡。而高糖對于P-AKT蛋白信號通路作用的抑制機(jī)制,尚需要深入探究。
依據(jù)本研究結(jié)果,發(fā)光二極管照射對大鼠高糖視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的光生物調(diào)節(jié)作用機(jī)制加以總結(jié)。其作用機(jī)制突出體現(xiàn)為,利用線粒體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)的方式,能有效實現(xiàn)光生物的調(diào)節(jié)[11]。通常情況下,對于功能不正常的組織、細(xì)胞等,光生物具有一定的調(diào)節(jié)作用。但是,對于正常功能的組織或是細(xì)胞來說,光生物調(diào)節(jié)并不能夠起到較好的作用和影響。也就是說,僅在較為特定的狀況下,選擇相對合理的參數(shù),使細(xì)胞康復(fù)作用得以發(fā)揮。發(fā)光二極管是亮度較高、效率較高且壽命較長的固體性光源,具有新穎性。目前,多項研究認(rèn)為低強(qiáng)度的發(fā)光二極管,光生物調(diào)節(jié)作用較為明顯[12-13]?,F(xiàn)階段對于光生物學(xué)的調(diào)節(jié)作用劑量關(guān)系,對于照射的劑量、時間和強(qiáng)度等,均具有明顯的差異。本次研究中結(jié)果顯示,正常對照組的細(xì)胞凋亡率顯著低于高糖模型組、發(fā)光二極管照射組,發(fā)光二極管照射組的細(xì)胞凋亡率顯著低于高糖模型組。正常對照組的P-AKT蛋白表達(dá)高于高糖模型組、發(fā)光二極管照射組,發(fā)光二極管照射組的P-AKT蛋白表達(dá)高于高糖模型組。可以證實,低強(qiáng)度的發(fā)光二極管照射,在一定程度上激活了抗凋亡的P-AKT蛋白通路,細(xì)胞凋亡數(shù)目有所減少,且細(xì)胞膜離子通道得以開啟,可對鈣信號傳導(dǎo)產(chǎn)生直接性的影響。此外,經(jīng)過低強(qiáng)度發(fā)光二極管照射,高糖模型組、正常對照組的差距比較明顯。分析其原因,高糖細(xì)胞模型組在照射實驗中,采用的培養(yǎng)基為25mmol/L的葡萄糖,這與我們前期研究工作相一致[4]。
目前,光生物調(diào)節(jié)治療的臨床研究較為廣泛,但是在DR患者治療的應(yīng)用,尚且存在不夠深入現(xiàn)象。本次研究中,通過對低強(qiáng)度發(fā)光二極管照射對大鼠高糖視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞光生物調(diào)節(jié)作用的觀察,可明確高糖對于P-AKT蛋白表達(dá)的抑制、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)均具有較大的影響,促使細(xì)胞凋亡,激活P-AKT蛋白的同時,可將其看作DR的輔助治療手段。
綜上所述,高糖環(huán)境可有效抑制蘇氨酸激酶通路活性,對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響,促使細(xì)胞凋亡,低強(qiáng)度的發(fā)光二極管照射可激活蘇氨酸激酶通路,降低高糖引起的細(xì)胞凋亡率。