林立 王建榮 鄭燕梅

【摘 要】 目的：優(yōu)化巴戟天醇提物的提取工藝，并評價其體外抗氧化活性。方法：對巴戟天醇提物的提取進行單因素實驗分析，然后通過清除ABTS、清除DPPH、清除超氧陰離子、還原力和總抗氧化五種方法評價巴戟天體外抗氧化活性。結(jié)果：最佳提取條件為乙醇提取濃度75 %，提取溫度100 ℃，提取時間2 h;巴戟天75 %醇提物對ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除能力，對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的最大清除率分別為48.016 %和28.782 %，還原力測試與總抗氧化能力實驗數(shù)值均與濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系。結(jié)論：巴戟天具有一定的體外抗氧化活性。

【關(guān)鍵詞】 巴戟天;抗氧化;自由基

【中圖分類號】R285.5 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2020）12-0042-05

Abstract：Objective Optimize the extraction process of alcohol extraction from Morinda officinalis and evaluate its antioxidant activity in vitro.Methods The alcohol extraction of Morinda officinalis was analyzed by single factor experiment，and then the antioxidant activity of Morinda officinalis was evaluated by five methods which were scavenging ABTS，removing DPPH，removing superoxide anion，reducing force and total antioxidant capacity. Results The optimum extraction conditions were ethanol extraction concentration 75 %，extraction temperature 100 ℃，extraction time 2 h，The part of 75 % alcohol extraction had some scavenging ability for ABTS radical，DPPH radical and superoxide anion radical，and the maximum scavenging rate for DPPH radical and superoxide anion radical was 48.016 % and 28.782 %，respectively. The experimental values of reducing force test and total antioxidant capacity showed a quantitative effect relationship with the concentration.Conclusior Morinda officinalis has antioxidant activity in vitro.

Keywords：Morinda officinalis How; Antioxidant Activity; Free Radical

巴戟天（Morinda officinalis How）是茜草科巴戟天屬多年生攀援性木質(zhì)藤本植物，別名巴戟、巴吉、雞腸風，產(chǎn)福建、廣東、海南、廣西等省區(qū)的熱帶和亞熱帶地區(qū)，中南半島也有分布[1]。全年均可采挖，洗凈，除去須根，其肉質(zhì)根的根肉曬干即成藥材“巴戟天”，和檳榔、益智、砂仁并稱為我國四大南藥，為福建省大宗道地藥材。中醫(yī)認為其性甘、辛、微溫，歸腎、肝經(jīng)，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功能，可用于陽痿遺精、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)、少腹冷痛、風濕痹痛，筋骨痿軟等病癥[2]。近年來，國內(nèi)外對巴戟天屬植物的化學成分及藥理活性研究較多，其化學成分主要有蒽醌類、萘醌和萘氫醌類、環(huán)烯醚萜類、糖類、木脂素類、脂肪苷類、香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類等，并不斷有新的化學成分被發(fā)現(xiàn);現(xiàn)代藥理學研究表明巴戟天能夠抗抑郁、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗丙型肝炎病毒作用、抗疲勞、保肝、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)控生精功能、抗腫瘤及細胞毒作用、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化等生物活性[3-9]。對于巴戟天的提取有多種方式，一般有水提取法、酸堿提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法、酶解法、微波提取法等，這些方法雖然提取率較高，但存在條件要求嚴格，操作復雜，成本較高等問題，個別方法又會破壞巴戟天的活性[10]。而對于單純乙醇提取的方法還少有提及，而且其實驗成本較低，操作簡單，提取物易于保存，因而選用乙醇為溶劑對巴戟天進行提取，研究巴戟天醇提物的生物活性。

現(xiàn)代醫(yī)學表明，人體內(nèi)多余的自由基，會破壞人體細胞結(jié)構(gòu)，引起脂質(zhì)的過氧化，進而干擾人體正常的代謝活動，引發(fā)疾病、加速人體衰老[11]。開發(fā)和利用高效無毒的天然抗氧化劑是一直是醫(yī)學研究的重點，目前對巴戟天的體外抗氧化研究相對較少，特別是醇提取物的抗氧化活性研究比較缺乏，為了進一步發(fā)掘巴戟天的用藥潛能，探究其抗氧化能力，本實驗通過進行總抗氧化能力、DPPH自由基清除活性、還原力、ABTS自由基清除活性和超氧陰離子自由基清除活性五種方法對巴戟天的體外抗氧化活性進行研究，為巴戟天的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 巴戟天藥材為野外人工采集，采集點位于福建省南靖縣，采集植物經(jīng)福建中醫(yī)藥大學楊成梓教授鑒定，認定為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的根。

1.2 試劑 ABTS、DPPH、NADH、NBT、PMS（美國Sigma公司）;磷酸鈉（聯(lián)試化工試劑有限公司）;硫酸（日本和光純藥工業(yè)株式會社）;十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀（國藥集團化學試劑有限公司）;三氯乙酸（天津市福晨化學試劑廠）;鉬酸銨、乙醇為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 儀器 DZF-6050電熱恒溫真空干燥箱（中新醫(yī)療儀器有限公司）;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮公司）;HH80數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州億能實驗儀器廠）;循環(huán)水式多用真空泵、低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州長城科技工貿(mào)有限公司）;電熱恒溫鼓風干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;多功能食品加工粉碎機（上海帥佳電子科學儀器廠）;千分之一天平（上海舜宇恒豐科學儀器有限公司）;萬分之一天平（福建省計量科技研究所）;十萬分之一天平（德國賽多利斯）;紫外-可見分光光度計（日本島津制作所）。

2 實驗方法

2.1 提取與分離 將巴戟天洗凈，置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥12 h，粉碎，過篩。采用熱溶劑提取法提取巴戟天醇提物，將藥液靜置一段時間后真空抽濾，合并兩次濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮，溫度保持30 ℃，回收乙醇至無醇味。取一定量巴戟天醇提物于真空干燥箱中烘干，備用。在巴戟天提取物的提取過程中主要涉及的因素是提取時的溶劑濃度、提取溫度、提取時間等。實驗分別探索它們對提取過程的影響，優(yōu)化巴戟天的提取過程。

2.1.1 乙醇濃度對巴戟天醇提物得率的影響 稱取巴戟天干燥物各等分，在溫度100 ℃條件下，提取2 h，分別使用55、65、75、85、95 %的乙醇溶劑進行提取，計算乙醇濃度對巴戟天醇提物得率，三次重復試驗。

2.1.2 提取溫度對巴戟天醇提物得率的影響 用75 %乙醇回流提取，每次2 h，分別在70、80、90、100、110 ℃進行提取，計算提取溫度對巴戟天醇提物得率，三次重復試驗。

2.1.3 提取時間對巴戟天醇提物得率的影響 在溫度100 ℃條件下，用75 %乙醇回流提取，分別提取1、1.5、2、2.5、3 h，計算時間對巴戟天醇提物得率，三次重復試驗。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 總抗氧化能力測定[12] 取0.25、0.5、1 mg/mL濃度的樣品溶液各0.3 mL（31.25～500 μg/mL）;加入3 mL的反應液（含0.6 M的硫酸，28 mM的磷酸鈉和4 mM的鉬酸銨），置于95 ℃的水浴中反應90 min，冷卻至室溫后，在紫外695 nm波長處測定吸光值（Ai），以BHT為陽性對照。各濃度樣品均重復以上步驟3次，并記錄數(shù)值。80 %乙醇替代樣品溶液作空白調(diào)零。

2.2.2 DPPH清除活性[13] 取5、10、20 mg/mL濃度的樣品溶液各2 mL，加入0.2 mol/L DPPH溶液2 mL，混勻后，置暗處30 min，使其充分反應，在紫外波長517 nm下分別測取各濃度吸光度（Ai），以Vc為陽性對照。各濃度樣品均重復以上步驟3次，并記錄數(shù)值。以80 %乙醇替代樣品溶液為空白對照，測定吸光度（A0）。

公式：DPPH自由基清除率（%）=[（A0-Ai）/A0]×100

式中：A0為空白對照吸光值;Ai為樣品吸光值。

2.2.3 還原力測定 [13] ?取2.5、5、10 mg/mL濃度的樣品溶液各2.5 mL，加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2.5 mL的1 %鐵氰化鉀溶液，充分混勻，置于50 ℃條件下水浴保溫20 min;加入2.5 mL的10 %三氯乙酸，搖勻并靜置10 min;取5 mL混合溶液，加入5 mL蒸餾水與1 mL的0.1 %氯化鐵，搖勻并靜置10 min，在紫外700 nm波長處測取各濃度吸光度（Ai）。各濃度樣品均重復以上步驟3次，并記錄數(shù)值。以2.5 mL的80 %乙醇替代樣品溶液作空白調(diào)零。

2.2.4 ABTS清除活性[14] 實驗用ABTS+溶液的制備：取等體積7 mM的ABTS與2.45 mM過硫酸鉀充分混勻，置23 ℃暗處反應12～16 h，得到ABTS+。加入80 %乙醇稀釋，使ABTS+溶液在紫外波長734 nm下的吸光值在（0.7±0.02）之間。

取10、20、40 mg/mL樣品溶液各0.1 mL，分別加入ABTS+（吸光度在0.7±0.02內(nèi)）溶液3.9 mL，充分混勻，置23 ℃反應6 min，在紫外734 nm波長處分別測取各濃度吸光度（Ai）。各濃度樣品均重復以上步驟3次，并記錄數(shù)值。用80 %乙醇溶液替代樣品溶液為空白對照，測定吸光度（A0）。

公式：ABTS自由基清除率（%）=（A0-Ai）×100/A0

式中：A0為空白吸光值;Ai為樣品吸光值。

2.2.5 超氧陰離子清除活性[15] 取0.25、0.5、1 mg/mL不同濃度的樣品溶液各1 mL，于體系中加入1 mL NBT溶液[156 μmol/L，由0.1 M的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制]，1 mL NADH溶液[468 沒μmol/L，由0.1 M的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制]，混勻，反應從加入1 mL PMS溶液[60 μmol/L，由0.1 M的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制]開始，置室溫反應5 min，在紫外波長560 nm處測定各濃度樣品Ai值。各濃度樣品均重復以上步驟3次，并記錄數(shù)值。以80 %乙醇替代樣品溶液為空白對照，測定吸光度（A0）。以0.1 M的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）調(diào)零。

公式：超氧陰離子清除率（%）=100×[A0-（Ai-Aj）]/A0

式中：A0為空白吸光值;Ai為樣品吸光值;Aj為樣品對照吸光值。

3 結(jié)果

3.1 優(yōu)化巴戟天醇提物的提取過程

3.1.1 乙醇濃度對巴戟天醇提物得率的影響 乙醇濃度在55 %～75 %的濃度范圍內(nèi)，巴戟天的醇提物得率隨著乙醇濃度的升高而增大，在75 %處有最大得率，為7.17 %，但隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大，得率沒有發(fā)生太大的變化。因而以下實驗中，選擇75 %的乙醇作為提取濃度進行提取。如圖1所示。

3.1.2 提取溫度對巴戟天醇提物得率的影響 巴戟天醇提物的得率隨著溫度的升高而增大，呈一定的量效關(guān)系，但是過高的溫度可能會使雜質(zhì)的溶出度增加，破壞巴戟天抗氧化物的生物活性[16]，因而以下實驗中，選擇100 ℃為提取溫度進行提取。如圖2所示。

3.1.3 提取時間對巴戟天醇提物得率的影響 巴戟天醇提物的得率隨著提取時間的改變，雖然時間越久，得率越高，但2 h后開始趨近于平穩(wěn)，時間越久需要耗費更多的財力物力，因而以下實驗中，因而選擇2 h作為提取時間進行提取。如圖3所示。

3.2 巴戟天醇提物的抗氧化實驗

3.2.1 總抗氧化能力 鉬酸銨法通過配制H2SO4、Na3PO4和H8MoN2O4三種溶液，形成磷鉬復合物，使用紫外分光光度法通過測試溶液吸光度的變化，從而對抗氧化能力進行定量分析。由圖4可知，吸光度A在1 mg/mL處數(shù)值為1.134，吸光度隨著樣品濃度的增大而增大，說明巴戟天75 %醇提取物有一定的總抗氧化能力。如圖4所示。

3.2.2 DPPH自由基清除能力 DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）是以N為中心，一種穩(wěn)定的有機自由基，在波長400～600 nm之間為中心處具有強烈的吸收，因此在溶液中呈現(xiàn)深紫色。與抗氧化劑單電子配對之后會褪色為無色或淺黃色，其吸光值的改變與抗氧化劑的清除能力成定量關(guān)系，溶液顏色隨著該自由基的減少而變淺，吸光度降低，因而可用分光光度法進行定量分析。隨著藥物濃度的增加，吸光度變小，清除率變大，當巴戟天75 %醇提取物濃度達到20 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率為48.016 %，說明巴戟天75 %醇提取物有清除DPPH自由基的能力。如圖5所示。

3.2.3 還原力 還原力強的物質(zhì)供應的電子可與自由基反應，使自由基成為穩(wěn)定的物質(zhì);當體系中存在還原性物質(zhì)時，鐵氰化鉀會被還原成亞鐵氰化鉀，F(xiàn)e3+還原為Fe2+，該產(chǎn)物與三氯化鐵反應，生成普魯士藍（Fe4[Fe（CN）6]3），其在紫外波長700 nm處有最大吸收峰，抗氧化劑的還原能力越強，則測量的吸光度越大。因此其抗氧化活性的能力可根據(jù)還原力的大小來進行判斷。吸光度A隨著樣品濃度的增大而增大，呈量效關(guān)系，在10 mg/mL濃度下，吸光度為0.194，說明巴戟天75 %醇提取物含有抗氧化物質(zhì)，具有一定的還原能力。見表1。

3.2.4 ABTS自由基清除作用 ABTS（2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）被過硫酸鉀氧化后，可生成藍綠色的陽離子自由基ABTS+，該自由基在紫外波長734 nm處有最大吸收峰。當抗氧化劑有清除該自由基的能力時，其吸光值的改變與抗氧化劑的清除能力成定量關(guān)系，溶液顏色隨著該自由基的減少而變淺，吸光度降低，因而可用分光光度法進行定量分析。隨著藥物濃度的增加，吸光度變小，清除率變大，當濃度在40 mg/mL時，清除率為8.858 %達到最高，說明巴戟天75 %醇提取物具有清除ABTS的活性，具有還原能力的物質(zhì)存在。見表2。

3.2.5 超氧陰離子自由基清除作用 NBT（氯化硝基四氮唑藍）在560 nm處有最大吸收峰。當抗氧化劑有清除該自由基的能力時，其吸光值的改變與抗氧化劑的清除能力成定量關(guān)系，溶液顏色隨著該自由基的減少而變淺，吸光度降低，因而可用分光光度法對被測物質(zhì)的還原能力進行定量分析。在1 mg/mL濃度條件下，巴戟天75 %醇提取物的清除率達到28.782 %，說明其對超氧陰離子有一定的清除作用，并且隨著樣品濃度的增大，清除率也跟著增大。見表3。

4 討論

巴戟天作為福建本土的道地藥材，具有很高的藥用及經(jīng)濟價值，對其的開發(fā)與利用一直是研究熱點。特別是近年來人們對人體健康的重視，從天然藥物中尋找抗氧化劑亦是一個研究的方向。自由基學說認為，生物體內(nèi)多余的自由基會使機體器官產(chǎn)生衰退性變化。在正常情況下，生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除會達到一個動態(tài)平衡，但內(nèi)源性的抗氧化物防御機制不足以應對由于衰老帶來的自由基，行之有效的辦法是通過補充體外抗氧化劑來減少生物體長期積累的氧化損傷[17]。實驗結(jié)果表明，巴戟天醇提物對ABTS自由基、超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，活性不是很顯著，但是能夠清除DPPH自由基，具有良好的總抗氧化能力和還原能力，表明巴戟天醇提部位存在清除自由基的物質(zhì)，但還需要對其活性物質(zhì)進一步的研究。細胞以及動物模型的測定值比體外化學提取法更具有生物相關(guān)性。為了能深入分析巴戟天活性物質(zhì)在生物體內(nèi)抗氧化的生物利用率及其物質(zhì)基礎(chǔ)，后續(xù)還需要利用細胞模型和動物模型來做進一步的研究。參考文獻

[1]羅獻瑞，高蘊璋，陳偉球，等. 中國植物志[M]. 北京：科學出版社，1999，71（2）：199.

[2]國家藥典委員會中華人民共和國藥典（一部）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：55.

[3]沈杰，馬恩耀，趙志敏，等. 巴戟天多糖的提取分離及生物活性研究進展[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2020，31（2）：246-250.

[4]蘇現(xiàn)明，王洪慶，陳若蕓，等. 巴戟天屬植物化學成分及藥理活性研究進展[J]. 中藥材，2017，40（4）：986-991.

[5]吳巖斌，吳錦忠，張巧艷，等. 巴戟天屬植物化學成分及生物活性研究新進展[J]. 解放軍藥學學報，2009，25（1）：64-67.

[6]CHOI J，LEE KT，CHOI M Y，et al. Antinociceptive anti-inflammatory effect of monotropein isolated from the root of Morinda officinalis [J]. Biol Pharm Bull，2005，28（10）：1915-1918.

[7]LI Y F，GONG Z H，YANG M，et al. Inhibition of the oligosaccharides extracted from Morinda officinalis，a Chinese traditional herbal medicine，on the corticosterone induced apoptosis in PC12 cells [J]. Life Sci，2003，72（8）：933-942.

[8]LI N，QIN L P，HAN T，et al. Inhibitory effects of Morinda officinalis extract on bone loss in ovariectomized rats [J]. Molecules，2009，14（6）：2049-2061.

[9]WU Y B，ZHANG Q Y，WU J Z，et al. Antiosteoporotic Activity of Anthraquinones from Morinda officinalis on Osteoblasts and Osteoclasts [J]. Molecules，2009，14（1）：573-583.

[10]陳忠，劉琳玲，何猛雄，等. 南藥巴戟天多糖提取方法的比較研究 [J]. 科技通報，2004，20（6）：546-548.

[11]王建英，任引哲，王迎新，等. 氧自由基與人體健康 [J]. 化學世界，2006，47（1）：61-63.

[12]PRIETO P，PINEDA M，AGUILAR，M. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex：Specific application to the determination of vitamin E [J]. Analytical Biochemistry，1999，269（2）：337-341.

[13]WANG H，GAO X D，ZHOU G C，et al. In vitro and in vivo antioxidant activity of aqueous extract from Choerospondias axillaris fruit [J]. Food Chemistry，2008，106（3）：888-895.

[14]FOROOGH BIGLARI，ABBAS F M，M. Antioxidant activity and phenolic content of various date palm（Phoenix dactylifera）fruits from Iran [J]. Food Chemistry，2008，107（4）：1636-1641.

[15]QIAO D，KE C L，HU B，et al. Antioxidant activities of polysaccharides from Hyriopsis cumingii [J].Carbohydrate Polymers：Scientific and Technological Aspects of Industrially Important Polysaccharides，2009，78（2）：199-204.

[16]程力惠，王建壯，盧麗霞，等. 正交設(shè)計優(yōu)選巴戟天中多糖提取工藝 [J]. 中藥材，2010，33（1）：125-127.

[17]王光慈. 食品營養(yǎng)學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：190-191.

（收稿日期： 編輯：）