張宏方，鄭 玉，李文俠，劉 洋，徐洋洋，王媛媛，張怡敏

（陜西中醫(yī)藥大學病原微生物及檢驗學教研室 咸陽 712046）

理沖湯為近代醫(yī)學家張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》里的治療婦人經(jīng)閉不行，或產后惡露不盡，結為癥瘕的經(jīng)典名方，現(xiàn)代臨床多用于對婦科腫瘤、女子不月、盆腔炎等女子常見病癥的治療[1]。我校腫瘤學科組，經(jīng)多年的實驗和臨床研究經(jīng)驗積累，以“理沖湯”（來源于《醫(yī)學衷中參西錄》）為基礎，化裁出對腫瘤具有抑制其轉移、增殖與調節(jié)荷瘤體免疫功能的調衡方。調衡方前期研究結果顯示[2-9]本方對抑制Lewis 肺癌的轉移有一定效果，該方提取的粗多糖可提升體外巨噬細胞的吞噬力及荷瘤體紅細胞免疫等功能，但調衡方對荷瘤體內巨噬細胞的作用如何？這方面仍未揭示清楚，本次實驗以荷瘤體腹腔巨噬細胞為靶點，從調控巨噬細胞吞噬能力及胞內酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）活性等途徑切入，探討調衡方抗瘤的巨噬細胞免疫作用及機制?，F(xiàn)總結如下文。

1 實驗材料

1.1 主要儀器和試劑

本研究的主要儀器包括：寶特Epoch 微孔板酶標儀為美國BioTek公司生產；ImagePro plus 6.0圖形分析版軟件為MediaCybernetic 公司產品；培養(yǎng)板與細胞培養(yǎng)瓶購自Coming 公司；CKX-41 型倒置顯微鏡購自Olympus 公司；CO2 培養(yǎng)箱為Napco 公司產品；722E 型分光光度計為上海光譜儀器有限公司產品；電子天平為上海精密儀器公司產品（FA1104N），層流凈化工作臺為北京市半導體設備廠產品），分析天平（ALC-110型，德國賽多利斯公司)；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-1型，天津市泰斯特儀器有限公司），離心機（LD4-2A型，北京醫(yī)用離心機廠）。細胞計數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；PH 值測定儀，上海精宏實驗設備有限公司。

本研究的主要試劑包括：貞芪扶正膠囊為甘肅新蘭藥藥業(yè)有限公司產品，批號J201510501。IL-1、IL-6、TNF-α試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司。Lewis 肺癌株，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。細 胞 培 養(yǎng) 液RPMI1640（Gibco），β-甘 油 磷 酸 鈉（Sigma），胰蛋白酶（華美生物工程公司產品）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）標準菌株ATCC26112（購自北京中國藥品生物制品檢定所）；FBS（fetal bovine serum）胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司產品）；青霉素與鏈霉素均為華北制藥股份有限公司產品；墨汁為倉南縣構思紙塑制品廠生產。

1.2 實驗藥物

調衡方組方中有生山藥30 g，生黃芪30 g，白花舌蛇草30 g，天花粉12 g，西洋參15 g，天門冬、生雞內金、莪術各10 g，水蛭3 g等，處方中的中藥經(jīng)陜西中醫(yī)大學附屬醫(yī)院藥劑科主任中藥師王凡的鑒定，全部符合二零一五版藥典質量標準的規(guī)定。對上述組方中的藥物，依據(jù)其性質，按一定的制備工藝，加工為lmL含生藥3 g流浸膏，分裝滅菌后備用。

1.3 實驗動物

C57BL/6 雄性小鼠（購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心），二級，體重（20±2）g，6～8 周齡，置本校生物技術與免疫實驗中心二級動物實驗室飼養(yǎng)。動物合格證號：SCXK（陜）2012-003。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥方法

按體重法將C57BL/6小鼠隨機分6組，每組10只，分別為正常組、荷瘤模型組、貞芪膠囊組（陽性組）、調衡方小、中、大劑組。將培養(yǎng)計數(shù)為6.5×106個/mL 的Lewis 肺癌接種于小鼠右側腋窩皮下，每只0.2 mL，復制成模型荷瘤小鼠（正常組除外）。于接種24 h 后灌胃給藥，用生理鹽水將調衡方每l mL 含生藥3 g 濃縮液稀釋為大、中、小劑組，且調配為等容積每只鼠0.2 mL 灌胃。依據(jù)動物與人體表面積折算公式，經(jīng)換算貞芪膠囊組（陽性組）用藥量為41.5 g/kg，調衡方大、中、小劑量組為50 g/kg、25 g/kg、12.5 g/kg，即每日每只小鼠灌胃生藥量陽性組0.83 g，調衡方大、中、小劑組用生藥量為1.0 g、0.5 g、0.25 g；荷瘤模型組給予生理鹽水等容量灌胃，給藥8天。

2.2 小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)、菌懸液的制取

依據(jù)文獻[10]與經(jīng)驗，于用藥8 天后，用75%酒精將脫頸處死的C57BL/6小鼠浸泡6 min左右，取出仰臥平放于無菌操作臺固定，從小鼠尾部至上腹部剝開小鼠毛皮，腹腔肌肉層露出，將無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液5 mL注入小鼠腹腔，靜待5 min左右（小鼠腹部輕揉2～3 min）后，用5 mL 無菌針管從腹腔兩側抽取約4.5 mL腹腔液，離心（1200 r·min-1，10 min）洗滌后顯微鏡下計數(shù)，調整細胞至所需濃度（培養(yǎng)液為含雙抗及10% 胎牛血清的RPMI-1640），置巨噬細胞于有無菌蓋玻片的6 孔板及24 孔板內，放入37℃5% CO2培養(yǎng)箱中，12 h后換液除去未貼壁的少數(shù)雜細胞，培養(yǎng)待用。

取菌種金黃色葡萄球菌接種在細菌固體平板培養(yǎng)基上，置37℃溫箱18～24 h 后，用接種環(huán)獲取5個左右菌落，放入無菌生理鹽水中混勻，用0.5 麥氏比濁管校正其濁度為1.5 × 108CFU（colony-forming units，CFU）/mL 的菌落形成單位，將此制備活化后的金葡菌的菌懸液貯存于4℃冰箱中備用。

2.3 指標及檢測方法

2.3.1 調衡方各干預組、荷瘤模型組與正常組活細胞的形態(tài)觀察

取調衡方各干預組、荷瘤模型組與正常組腹腔巨噬細胞培養(yǎng)24 h 后，置于倒置顯微鏡下觀察各組巨噬細胞的形態(tài)變化特征。

2.3.2 墨汁吞噬試驗

各干預組培養(yǎng)48 h 后的巨噬細胞，每孔中加入墨汁（稀釋2 倍）20 μL，6 孔板繼續(xù)放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約4 h 左右，觀察（倒置顯微鏡下）各干預組巨噬細胞吞噬墨汁的狀況。當發(fā)現(xiàn)各干預組及正常對照組細胞有墨汁顆粒被吞入時，洗滌細胞（用RPMI-1640不含血清的培養(yǎng)液），然后用10%甲醛固定細胞，甘油明膠封片，再用有照相功能的倒置顯微鏡觀察拍照。用ImagePro plus 6.0 圖形分析軟件計算其陽性表達百分率。

2.3.3 吞噬金葡菌試驗

各干預組培養(yǎng)48 h 后的巨噬細胞，每孔中加入金黃色葡萄球菌懸液50 μL，24 孔板繼續(xù)放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約隔24 h，輕吸各組10 孔中的菌懸液，加入722E 型分光光度計比色皿內，于560 nm 處測定每組的吸光度A值。

圖1 不同各組對巨噬細胞形態(tài)的影響（200×）

2.3.4 胞內經(jīng)ACP染色的Mφ活性觀察

各干預組培養(yǎng)48 h 后的巨噬細胞，棄去每孔中的培養(yǎng)液，于4℃冰箱內用10%中性甲醛固定細胞30 min，然后用水洗5 min，再用酸性磷酸酶孵育液（含蒸餾水90 mL，5%醋酸鉛4 mL，2%β-甘油磷酸鈉4 mL，0.2 mol/L 磷酸緩沖液10 mL）于37℃溫育30 min，自來水漂洗，再用1%硫化銨處理4 min 左右，繼續(xù)用自來水沖洗后，用鑷子取出爬有Mφ的蓋玻片，明膠甘油封片，再用有照相功能的倒置顯微鏡觀察胞內經(jīng)ACP 染色的Mφ活性并拍照。用ImagePro plus 6.0 圖形分析軟件計算其陽性表達百分率。

2.3.5 酶聯(lián)免疫吸附測定檢測巨噬細胞上清中IL-1、IL-6、TNF-α的表達水平

將獲取的小鼠腹腔巨噬細胞去雜純化后，均勻接種到培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)48 h，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各培養(yǎng)組Mφ上清中IL-1、IL-6、TNF-α三項指標，在450 nm處使用酶標儀測定其A值。

2.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，實驗數(shù)據(jù)是以各實驗組與荷瘤模型組進行兩組間t檢驗，各數(shù)據(jù)均采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件分析處理。

3 結果

3.1 調衡方干預及荷瘤模型組對巨噬細胞形態(tài)的影響

荷瘤對照Mφ組與正常組Mφ形態(tài)比較，其在形態(tài)上大小、數(shù)量有較大的差異，荷瘤對照組巨噬細胞形態(tài)瘦小，數(shù)量稀少，多為小圓形，表明固有Mφ免疫功能極度低下。正常組的Mφ形態(tài)多呈橢圓形、圓形及帶尾的三角形，有的巨噬細胞形態(tài)帶有長的尾巴呈蝌蚪行，一些Mφ有偽足或突起且數(shù)量多而飽滿；而調衡方干預各組、貞芪膠囊組巨噬細胞的體積較荷瘤模型組的明顯增大。見圖1A，B，C，D，E，F(xiàn)。

3.2 調衡方干預及荷瘤模型組對巨噬細胞吞噬墨汁的影響

調衡方各組干預后，體外培養(yǎng)巨噬細胞48 h，再加墨汁4 h 左右，荷瘤對照組與正常組巨噬細胞吞噬墨汁相比，荷瘤模型組吞噬墨汁顆粒數(shù)量顯著降低，差異非常顯著（P＜0.01），本次實驗發(fā)現(xiàn)，調衡方大、中劑量組及貞芪組Mφ吞噬的墨汁顆粒數(shù)目比之荷瘤組及小劑量組明顯增多。而在墨汁吞噬陽性面積的計算中，調衡方大、中劑量組及貞芪組與荷瘤組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而小劑量濃度組細胞內的墨汁顆粒與對照組比較增多不明顯（P＞0.05）。見圖2中A，B，C，D，E，F(xiàn)和圖3。

表1 調衡方對荷瘤小鼠巨噬細胞中吞噬墨汁、酸性磷酸酶染色及對金葡菌吸光度值的測定結果（±s）

表1 調衡方對荷瘤小鼠巨噬細胞中吞噬墨汁、酸性磷酸酶染色及對金葡菌吸光度值的測定結果（±s）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與荷瘤對照組比較，※P＜0.05；※※P＜0.01；NS：0.9%氯化鈉；☆：各組動物均為10只。

組別☆正常對照組荷瘤對照組貞芪膠囊組調衡方小劑量組調衡方中劑量組調衡方大劑量組劑量/（g·kg-1）NS NS 41.512.52550吞噬墨汁陽性率/%4.43±0.60※※1.14±0.33△△3.70±0.82※※2.38±1.915.42±1.50※※6.72±1.28※※ACP染色陽性率/%2.19±0.86※※1.02±0.59△△3.67±1.91※※1.54±0.594.66±1.50※※5.18±1.53※※A值/吸光度值0.313±0.038※0.355±0.045△0.286±0.037※※0.341±0.0590.273±0.051※※0.245±0.037※※

3.3 調衡方干預及荷瘤模型組對巨噬細胞吞噬金葡菌的影響

用藥各組體外培養(yǎng)巨噬細胞48 h，在金葡菌懸液干預后，荷瘤模型組與正常組比較，吸光度值明顯降低（P＜0.05），而調衡方干預各組與荷瘤模型組比較，大、中濃度組及貞芪膠囊組巨噬細胞吞噬作用明顯，吸光度值明顯降低（P＜0.01），而調衡方小劑組無明顯差異（P＞0.05），說明調衡方能增強Mφ對金葡菌的清除力。見表1和圖4。

圖3 不同各組培養(yǎng)巨噬細胞48 h后的吞噬墨汁狀態(tài)

3.4 調衡方干預及荷瘤模型組對巨噬細胞酸性磷酸酶的影響

各干預組培養(yǎng)48 h 后的Mφ組與荷瘤模型組比較，發(fā)現(xiàn)調衡方各組Mφ內ACP染色的顏色較深，且呈劑量依賴性，劑量越大，染色越深，這說明調衡方對Mφ內ACP 含量有顯著提高作用，且在ACP 染色陽性面積的計算中，大、中劑量組與荷瘤組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。貞芪組不論是鏡下觀察還是在面積百分比計算中，同樣表現(xiàn)出對Mφ強大的激活作用（P＜0.01），而調衡方小劑組無明顯差異（P＞0.05）。見圖5中A，B，C，D，E，F(xiàn)和圖6。

3.5 調衡方對巨噬細胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α的影響

小鼠接種荷瘤后IL-1、IL-6及TNF-α均有不同程度升高（P＜0.01），與荷瘤組比較，調衡方大、中劑量以及貞芪組中Mφ上清因子IL-1、IL-6 以及TNF-α含量顯著下降（P＜0.05；P＜0.01），但小劑量組無明顯變化。調衡方劑量的大小與IL-1、IL-6以及TNF-α的含量呈負相關，說明調衡方能夠通過降低Mφ分泌上清因子如IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子來減少腫瘤的浸潤，從而減緩腫瘤的發(fā)展。見表2、圖7。

圖4 各組巨噬細胞吞噬金黃色葡萄球菌的吸光度A值狀況

4 討論

圖7 各組上清液中IL-1、IL-6、TNF-α濃度（與荷瘤對照組比）

肺癌位于惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率的前列，其生存率不足20%，且沒有明顯的提升跡象，男性惡性腫瘤中肺癌居首位，而女性僅排其后[11-12]?，F(xiàn)代醫(yī)學多以手術與化療來治療該病，其短期療效明確而肯定，但長期療效因免疫受損低下而致癌細胞轉移與化療毒副作用的制約而不容樂觀。肺癌屬于“肺積”“癌病”“積聚”等范疇，其病機是氣、血、痰、瘀、毒凝滯而成。調衡方具有益氣生血養(yǎng)陰、清熱解毒、活血祛瘀之功效。前期研究結果顯示[2-9]本方可抑制Lewis 肺癌的轉移，可提升機體免疫等功能，本研究以荷瘤體腹腔Mφ為作用點，從調控Mφ吞噬能力及胞內ACP 的活性等的途徑切入，探討了調衡方對荷瘤鼠的巨噬細胞免疫作用的影響。

表2 各組上清液中IL-1、IL-6、TNF-α的含量（單位pg/mL，±s）

表2 各組上清液中IL-1、IL-6、TNF-α的含量（單位pg/mL，±s）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與荷瘤對照組比較，※P＜0.05；※※P＜0.01；NS：0.9%氯化鈉；☆：各組動物均為10只。

組別☆正常對照組荷瘤對照組貞芪膠囊組調衡方小劑量組調衡方中劑量組調衡方大劑量組劑量/（g·kg-1）NS NS 41.512.52550 IL-113.9±4.2534.75±1.65△△20.16±3.55※※32.79±2.5026.19±3.09※19.53±4.67※※IL-664.4±7.98117.9±17.36△△71.86±7.87※※107.07±14.7691.44±10.26※67.16±8.28※※TNF-α 72.36±8.89101.62±3.83△△81.57±6.89※※98.15±5.8286.13±6.69※79.19±9.42※※

現(xiàn)代研究表明，長期機體免疫抑制或低下，發(fā)生腫瘤的概率將高，同時，腫瘤增殖期間患者的免疫功能被抑制，二者也互為因果[13]。針對腫瘤免疫力低下病變的預防治療，中醫(yī)藥已有數(shù)千年的理論及臨床應用經(jīng)驗，中醫(yī)的“益氣”可直接扶助正氣；“解毒”能減少邪氣對正氣的耗傷；“活血化瘀”能夠祛除局部瘀血阻滯，消除積聚或癥瘕，恢復病灶的血液循環(huán)，使瘀血去，新血生，化生正氣。則“益氣解毒化瘀”能增加機體的“正氣”,而“正氣”盛,則機體的“免疫力”強。因此，采用益氣生血養(yǎng)陰、清熱解毒、活血祛瘀之功效的調衡經(jīng)驗方，可用于治療轉移性肺癌。況大量研究表明，“益氣生血、化瘀解毒”復方中藥可通過多方面調節(jié)機體免疫功能，從而達到抑制腫瘤的作用[14-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，調衡方大、中各組對Mφ吞噬墨汁力明顯增強，對金黃色葡萄球菌菌懸液的廓清吞噬力明顯提升，與荷瘤對照組比較有顯著統(tǒng)計學差異；與荷瘤對照組比較，調衡方各組干預后的ACP 活性含量均表現(xiàn)出不同程度的提升，隨著劑量增大，Mφ胞內ACP 活性增加明顯。

巨噬細胞主要參與體內固有免疫應答，也作為重要的抗原提呈細胞而參與適應性免疫應答，其表面有多種受體，如Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）與脂多糖（lipoplysaccharide，LPS）受體等，其胞內有多種酶，巨噬細胞兩個最大的特征就是強大的吞噬外來異物（如吞噬墨汁、雞紅細胞）與ACP 酶活性高。當外來異物與巨噬細胞表面的受體結合后，其便被激活，這時其體積增大，吞噬活力巨增，胞內多種酶活性顯著增強，尤其是ACP 升高是巨噬細胞被激活的標志之一[19-20]，同時，Mφ廓清異物的功能增強，Mφ清除胞內物主要靠其吞噬溶酶體消化處理，強大的吞噬溶酶體除了清除異物外，還可以將異物的特異性抗原肽提呈給T 淋巴細胞，即Mφ不僅參與固有免疫應答，還參與適應性免疫應答。本次實驗結果顯示，調衡方能夠增強Mφ吞噬及廓清能力，激活ACP 酶活性，刺激Mφ成熟活化，而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

炎性因子TNF-α,IL-1 及IL-6 為Mφ所分泌，Mφ對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著不可忽略的正/負調節(jié)，已有研究證實IL-1、IL-6、TNF-α在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著“雙刃劍”的角色[21-25]。腫瘤生長的早期階段，Mφ的免疫吞噬作用及抗原呈遞作用表現(xiàn)為高水平的Mφ浸潤可以抑制腫瘤生長，而在低濃度下支持腫瘤生長[26-27]。在炎性過程中Mφ所分泌的TNF-α,IL-1 及IL-6 炎性因子起到關鍵作用。本實驗結果表明，調衡方能夠抑制Mφ分泌炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α，從而降低腫瘤浸潤，延緩腫瘤轉移及發(fā)展。

綜上所述，可推測調衡方對Lewis 肺癌荷瘤體的治療，可能與其降低炎癥細胞因子，提升巨噬細胞吞噬廓清力及胞內ACP 酶活性增高有關。而IL-1、IL-6、TNF-α又是調控巨噬細胞分型的重要細胞因子。這為本課題組后續(xù)探討調衡方是否重塑Mφ以M1 增多為主，指明了研究方向。