屈孟錦 梁正敏 王元智 周向梅

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)，特別是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性消耗性人畜共患病，是世界上最重要的致死性傳染病之一[1]。盡管卡介苗(BCG)及抗結(jié)核藥品如鏈霉素、異煙肼、利福平等相繼問世，但是MTB與HIV雙重感染，以及MTB耐藥菌株的出現(xiàn)使得結(jié)核病的發(fā)病率和病死率仍然處于較高水平。據(jù)WHO[2]估算，2018年全世界約有145萬例患者死于結(jié)核病，結(jié)核病已經(jīng)成為世界范圍的公共衛(wèi)生問題。

MTB是一種胞內(nèi)寄生菌，主要寄生在宿主的巨噬細(xì)胞中，早先人們普遍認(rèn)為MTB依靠巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)和膽固醇建立和維持慢性感染[3-4]；但是隨著研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)MTB的代謝網(wǎng)絡(luò)可以對(duì)多種碳底物同時(shí)進(jìn)行分解代謝，并且這種代謝方式作為致病機(jī)制促進(jìn)MTB應(yīng)對(duì)不斷變化的微環(huán)境[5-6]，越來越多的證據(jù)表明糖代謝在MTB的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位，筆者以MTB糖代謝為線索將現(xiàn)有的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、MTB糖代謝

MTB通過傳染性氣溶膠進(jìn)入宿主，巨噬細(xì)胞吞噬吸入MTB后穿過肺泡上皮細(xì)胞到達(dá)肺中，被感染的巨噬細(xì)胞募集其他的巨噬細(xì)胞和免疫細(xì)胞形成肉芽腫結(jié)構(gòu)，肉芽腫中的巨噬細(xì)胞在低氧狀態(tài)下生長速度和遷移大大降低，呈現(xiàn)相對(duì)靜止的狀態(tài)[7]。為了適應(yīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)部的低氧環(huán)境，MTB的代謝方式從有氧轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬跄Ｊ剑墙徒馔緩较嚓P(guān)基因的表達(dá)被上調(diào)，MTB所需能量的70%來自于糖酵解[8]。由此看來，糖酵解對(duì)于MTB在宿主體內(nèi)的存活至關(guān)重要。早在1998年Cole等[9]將MTB代表菌株H37Rv進(jìn)行全基因組測(cè)序，結(jié)果表明MTB除了具有脂質(zhì)代謝的酶外，還具有糖酵解、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)、三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)和乙醛酸循環(huán)所需要的酶；而后Titgemeyer等[10]分析H37Rv基因組發(fā)現(xiàn)，MTB具有5種碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Sassetti和Rubin[11]發(fā)現(xiàn)碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān)基因是MTB在小鼠建立感染的過程中必不可少的基因。這些研究表明，碳水化合物是MTB不可或缺的能量來源，糖代謝在MTB生長與感染中發(fā)揮著重要的作用。

二、MTB中糖的轉(zhuǎn)運(yùn)與合成

(一)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

在恥垢分枝桿菌基因組中共評(píng)估出28種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而在MTB基因組中僅預(yù)測(cè)出5種，這表明宿主很難為MTB提供富含多種糖類的環(huán)境，也解釋了MTB在僅含有糖類的培養(yǎng)基中生長緩慢的原因。這5種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分別是UgpABCE、LpqY-SugABC、UspABC、Rv2038c-Rv2041c和SugI，前4種屬于三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)結(jié)合盒式(ATP-binding cassette，ABC)蛋白家族，最后1種屬于主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)蛋白。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與其他細(xì)菌物種的同源性較低，因此并不能清楚地對(duì)它們的底物進(jìn)行預(yù)測(cè)[10,12]，MTB如何利用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)碳水化合物仍有待研究。

MTB的ABC糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于MTB的生理與致病性具有重要作用，可以用于研發(fā)新型抗結(jié)核藥品與疫苗(表1)。MTB UgpABCE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與大腸埃希菌的麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)相似，同屬于碳水化合物攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1亞家族，但是卻不能和大腸埃希菌的UgpB亞基一樣與3-磷酸甘油酯(sn-glycerol-3-phosphate，G3P)特異性結(jié)合，而是與甘油磷酸膽堿結(jié)合，這是因?yàn)榇竽c埃希菌UgpB亞基的169位的色氨酸被證明與G3P結(jié)合必不可少，而MTB UgpB中的169位的色氨酸被205位的亮氨酸取代。此外，MTB UgpB也是雙精氨酸易位途徑的底物，對(duì)于病原體的致病性至關(guān)重要[13]。LpqY-SugABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以高度特異性地識(shí)別海藻糖，并且對(duì)于MTB在巨噬細(xì)胞和小鼠中建立感染至關(guān)重要，當(dāng)阻斷這種功能時(shí)MTB的致病性降低[14]。需要指出的是，海藻糖在哺乳動(dòng)物中并不存在，并且攝入的海藻糖也會(huì)被海藻糖酶分解為葡萄糖，這說明宿主內(nèi)部環(huán)境中的糖類很難進(jìn)入MTB。UspABC在不同的分枝桿菌物種中是相對(duì)保守的，其UspC亞基偏向結(jié)合C2或者C3處帶有氨基的糖，并且該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被證明對(duì)于MTB體外生長也是必不可少的[15]。Rv2038c-Rv2041c尚未確定其確切的底物，但是研究發(fā)現(xiàn)Rv2041c可以增強(qiáng)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，它可以促使巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子分泌增多，對(duì)感染MTB的小鼠及活躍的結(jié)核病患者產(chǎn)生積極的抗體反應(yīng)，可用于MTB感染的血清學(xué)診斷[16]。至于MTB SugI轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并沒有相關(guān)文獻(xiàn)介紹，科研人員需要繼續(xù)開展相關(guān)研究。

表1 結(jié)核分枝桿菌ABC糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要發(fā)現(xiàn)

(二)糖異生

糖異生不僅可以將脂質(zhì)或氨基酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖滿足MTB自身的需要，而且還會(huì)影響MTB的致病性。糖異生對(duì)于MTB致病性的作用最早源于異檸檬酸裂合酶(isocitrate lyase，ICL)(圖1)的研究，ICL是乙醛酸循環(huán)中重要的限速酶，乙醛酸循環(huán)的產(chǎn)物可以作為糖異生的底物，因此ICL可以促進(jìn)碳源向糖異生途徑的流動(dòng)。編碼ICL基因的缺失減弱了MTB在小鼠中的致病性和持久性，這說明糖異生途徑對(duì)MTB的致病性和持久性產(chǎn)生了影響[17]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)、1,6-二磷酸果糖醛縮酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase，F(xiàn)BA)和磷酸三糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase，TPI)(圖1)是糖異生和糖酵解中重要的功能酶。其中，編碼PEPCK的基因pckA在MTB感染巨噬細(xì)胞和小鼠的過程中均被誘導(dǎo)表達(dá)，pckA敲除的MTB突變體不能在小鼠肺中建立和維持感染[18-19]。另外，編碼FBA和TPI基因的缺失會(huì)導(dǎo)致MTB在小鼠感染模型中被迅速清除[20-21]。盡管這些研究表明上述3種功能酶對(duì)于MTB的致病性具有重要影響，但是由于這些酶具有回補(bǔ)活性，因此并不能完全說明糖異生對(duì)于MTB致病性的作用。二磷酸果糖磷酸酯酶(fructose bisphosphatase，F(xiàn)BP)是糖異生中重要的限速酶；MTB中有2種FBP，當(dāng)這兩個(gè)FBP功能缺失時(shí)，糖異生途徑被阻斷，MTB在小鼠肺臟中被清除[22]。FBP催化的反應(yīng)僅單向進(jìn)行，因此FBP活性的消除只會(huì)破壞糖異生，而不會(huì)使糖酵解受到干擾，從而直接肯定了糖異生在MTB致病性中的特定作用。

三、MTB糖分解代謝中的功能酶

MTB可以通過多種方式進(jìn)行糖代謝(圖1)，包括糖酵解途徑、PPP及TCA循環(huán)，在這個(gè)過程中有許多重要的限速酶發(fā)揮著不可或缺的作用，這些功能酶可能成為新型抗結(jié)核藥物的理想靶標(biāo)。

NADPH：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADP+是NADPH的氧化形式；PPGK：多磷酸葡萄糖激酶；GLKA：葡萄糖激酶；PFKA：磷酸果糖激酶A；FBP：二磷酸果糖磷酸酯酶；FBA：1,6-二磷酸果糖醛縮酶；TPI：磷酸三糖異構(gòu)酶；PYK：丙酮酸激酶；PEPCK：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；ICL：異檸檬酸裂合酶；“+”代表該物質(zhì)對(duì)于PYK為正反饋，“-”代表該物質(zhì)對(duì)于PYK為負(fù)反饋圖1 MTB糖代謝示意圖

(一)葡萄糖激酶

葡萄糖磷酸化是糖酵解的第一個(gè)反應(yīng)，也是極其重要的一個(gè)限速步驟。MTB表達(dá)兩種功能性葡萄糖激酶，即多磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase， PPGK)與葡萄糖激酶(glucokinase，GLKA)；它們可以將葡萄糖催化生成6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate，G6P)，其中PPGK包含5個(gè)葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)和2個(gè)ATP結(jié)合域，GLKA僅包含3個(gè)葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)ATP結(jié)合域，這意味著PPGK與GLKA相比可以結(jié)合更多的底物，催化效率也更高，因此PPGK發(fā)揮主要作用。當(dāng)從MTB基因組中同時(shí)敲除編碼PPGK和GLKA的基因后，MTB則無法使用外部葡萄糖作為生長或代謝的底物，令人驚訝的是，該突變體在小鼠肺中喪失了生存能力，不能在慢性感染階段持續(xù)存在，這樣的結(jié)果表明MTB在小鼠中建立MTB慢性感染依賴于葡萄糖磷酸化，MTB的代謝靈活性對(duì)其致病機(jī)制至關(guān)重要，病原體并不完全依賴宿主脂質(zhì)的代謝[23]。

(二)磷酸果糖激酶

6-磷酸果糖的磷酸化是糖酵解的關(guān)鍵步驟，該步驟可由磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)催化。已知pfkA和pfkB兩個(gè)基因編碼PFK，這兩種基因不僅核苷酸序列上具有差異，并且編碼蛋白的功能也有很大不同，PFKA屬于PFK蛋白家族，而PFKB屬于核酸激酶超蛋白家族。僅PFKA 在MTB中發(fā)揮PFK活性[24]，而PFKB屬于休眠生存調(diào)節(jié)子，在缺氧和活化的巨噬細(xì)胞中會(huì)被上調(diào)表達(dá)[25]。研究表明，PFKA和PFKB都不是MTB體外和體內(nèi)生存的必要條件，但是當(dāng)葡萄糖作為MTB唯一的碳來源時(shí)，PFKA對(duì)于MTB糖酵解是必不可少的，另外，在缺氧條件下MTB的生存需要PFKA[11,24]。

(三)FBA

FBA催化1,6-二磷酸果糖裂解為磷酸二羥基丙酮(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)和G3P。FBA分為Ⅰ類與Ⅱ類，MTB FBA屬于Ⅱ類，需要借助二價(jià)金屬陽離子(例如Zn2+)來穩(wěn)定烯醇鹽中間體。在體外標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下不能分離出編碼FBA基因的轉(zhuǎn)座子突變體，也不能通過同源重組從MTB染色體上刪除編碼FBA的基因[26]，這些研究表明編碼FBA的基因是MTB的必需基因。MTB在含有葡萄糖或糖異生底物的單一碳源培養(yǎng)基中的正常生長需要FBA，這表明FBA是糖酵解和糖異生過程中必不可少的酶。在小鼠感染MTB期間，肺臟中MTB FBA被誘導(dǎo)表達(dá)，并且在缺氧期間FBA表達(dá)增強(qiáng)，MTB需要FBA活性才能在急性感染以及慢性感染階段維持正常生長。另外，MTB分泌的FBA可以與宿主纖維蛋白溶酶結(jié)合，這表明FBA可能參與宿主與病原體的相互作用[20,26]。

(四)TPI

TPI催化DHAP和G3P的相互轉(zhuǎn)化，該反應(yīng)對(duì)于糖酵解和糖異生是十分重要的。TPI是一種高度保守的酶，MTB TPI與其他細(xì)菌具有極高的結(jié)構(gòu)相似性。TPI的活性會(huì)受到磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)的調(diào)控，PEP可以競(jìng)爭性地抑制DHAP和G3P的相互轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致PPP通量增加，使得MTB在氧化應(yīng)激的情況下滿足對(duì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的需求，維持正常的生理狀態(tài)[27]。TPI缺失突變體不能在單一的碳底物下存活，但是當(dāng)糖酵解和糖異生的底物同時(shí)存在時(shí)會(huì)像野生型MTB一樣正常生長。并且通過同位素示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)TPI缺失時(shí)TPI底物會(huì)不斷積累，這說明不存在其他TPI和代謝旁路反應(yīng)，這也反映出TPI對(duì)MTB糖酵解和糖異生的重要地位。此外，當(dāng)使用TPI缺失突變體感染小鼠后，TPI缺失菌株迅速在小鼠體內(nèi)消除，小鼠的脾臟和肺臟均無任何病理變化，這說明在小鼠中建立MTB感染需要TPI[21]。

(五)丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PYK)

PYK催化糖酵解最后一步，將PEP轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)而進(jìn)入TCA循環(huán)，是碳通量分布的中心轉(zhuǎn)換點(diǎn)。PYK是調(diào)節(jié)糖酵解與糖異生轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵點(diǎn)，可防止二者之間的無效循環(huán)。PYK對(duì)于MTB在含有葡萄糖以及短鏈脂肪酸培養(yǎng)基中的生長都是必不可少的，但是在MTB小鼠感染模型中PYK并不是必不可少的[28]。當(dāng)編碼PYK的基因缺失時(shí)，牛分枝桿菌中心代謝發(fā)生顯著變化，蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果顯示糖異生相關(guān)蛋白下調(diào)，并且脂肪酸分解代謝相關(guān)蛋白上調(diào)，牛分枝桿菌將利用脂肪酸作為能源[29]。在MTB中PYK的活性受到多種代謝產(chǎn)物的影響，糖酵解代謝產(chǎn)物G6P和1,6-二磷酸果糖均可以作為變構(gòu)活化劑激活PYK，而糖酵解代謝產(chǎn)物G3P和PPP產(chǎn)物單磷酸戊糖抑制PYK的活性狀態(tài)，通過PYK精細(xì)又復(fù)雜的變構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制，促進(jìn)MTB迅速適應(yīng)變化的宿主環(huán)境[29-31]。

四、糖代謝是MTB維持穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制

MTB在宿主中從最初的肺泡巨噬細(xì)胞感染到肉芽腫的發(fā)展，以及肺外擴(kuò)散的過程中會(huì)遇到一系列不同的微環(huán)境，宿主細(xì)胞會(huì)采取各種措施抵制MTB的生存與繁殖[32-34]。MTB則會(huì)不斷地調(diào)整自身基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)來應(yīng)對(duì)不斷變化和不利的生存環(huán)境，其中代謝方式的調(diào)整與適應(yīng)是一種重要的應(yīng)對(duì)方式[35-36]，糖代謝就是一種重要的維穩(wěn)機(jī)制。

(一)糖代謝可短期緩解貝達(dá)喹啉(bedaquiline，Bdq)的殺菌作用

Bdq：貝達(dá)喹啉；ATP：三磷酸腺苷；“+”代表上調(diào)，“-”代表下調(diào)圖2 MTB受到Bdq刺激的相關(guān)反應(yīng)模式圖

Bdq是ATP合成酶抑制劑，是數(shù)年來首個(gè)被批準(zhǔn)用于治療耐藥結(jié)核病的藥物，但是在臨床應(yīng)用中Bdq用藥3～4 d卻沒有明顯的溶菌作用，MTB的這種防御機(jī)制與MTB代謝重塑相關(guān)聯(lián)(圖2)。在Bdq的刺激下氧化磷酸化受到限制，MTB迅速做出反應(yīng)，上調(diào)休眠調(diào)節(jié)因子并且下調(diào)生物合成途徑，最大程度地降低ATP消耗。同時(shí)，MTB會(huì)增強(qiáng)ATP的生成途徑，蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果顯示，乙醛酸循環(huán)以及TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶顯著上調(diào)，MTB將碳源通過乙醛酸循環(huán)引至TCA循環(huán)產(chǎn)生能量。此外，當(dāng)MTB使用不可發(fā)酵的能源(例如脂肪酸)培養(yǎng)時(shí)，Bdq誘導(dǎo)的殺菌作用會(huì)顯著增強(qiáng)，但是當(dāng)使用可發(fā)酵能源(例如葡萄糖、甘油)培養(yǎng)時(shí)，Bdq誘導(dǎo)的殺菌作用則會(huì)減弱，這表明糖酵解途徑對(duì)于MTB的存活顯然必不可少。糖酵解產(chǎn)生的ATP足以維持細(xì)菌活力數(shù)天，并同時(shí)防止殺傷，只是在持續(xù)抑制ATP合成酶后，這種替代途徑顯然是不夠的[37-38]。類似的延遲效應(yīng)也出現(xiàn)在PA-824、Q203等抗結(jié)核候選藥品中[39-40]，這些藥品直接或間接的靶向了MTB的呼吸鏈，影響了ATP的合成，代謝重塑是否也在其中發(fā)揮作用，這需要科研人員繼續(xù)深入研究。

(二)糖酵解可限制低氧狀態(tài)下有毒代謝產(chǎn)物的積累

在體外低氧的條件下，MTB進(jìn)入非復(fù)制狀態(tài)，此時(shí)葡萄糖對(duì)于MTB具有毒性作用，當(dāng)培養(yǎng)基中缺少葡萄糖時(shí)，MTB可以在非復(fù)制狀態(tài)下維持更久的時(shí)間。當(dāng)糖酵解途徑被阻斷時(shí)，葡萄糖對(duì)于MTB的毒性作用則會(huì)加劇[24]。這可能與糖酵解途徑中積累的有毒代謝中間產(chǎn)物有關(guān)，糖磷酸鹽對(duì)菌體有毒并不斷積聚損害細(xì)胞的生存能力，有報(bào)道稱糖磷酸鹽會(huì)降低MTB的細(xì)胞活力最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[41]。除此以外，糖酵解途徑的阻斷可能影響其他代謝途徑從而降低了細(xì)菌的生存能力?？傊S持MTB完整的糖酵解會(huì)在一定程度上緩解這些有毒代謝產(chǎn)物的積累，從而適應(yīng)不利的微環(huán)境。

(三)PPP可緩解低氧環(huán)境對(duì)MTB的損傷

為了應(yīng)對(duì)低氧帶來的不利影響，MTB調(diào)整代謝程序，降低糖酵解速率并且增強(qiáng)乙醛酸循環(huán)和糖異生活性，從而克服糖酵解使碳源重新流向PPP[42]。PPP是將葡萄糖直接氧化脫羧產(chǎn)生磷酸戊糖和NADPH的代謝方式，在這個(gè)過程中，磷酸戊糖和G6P利用構(gòu)象動(dòng)力學(xué)中的差異精細(xì)地調(diào)節(jié)PYK的活性，降低通過PYK的碳通量，減少碳逆流至TCA循環(huán)以二氧化碳的形式散失[30,43]。PPP中間產(chǎn)物可以為核苷酸、芳香族氨基酸等多種物質(zhì)提供原料，這些產(chǎn)物的積累是預(yù)期代謝調(diào)節(jié)反應(yīng)的結(jié)果，是MTB重新進(jìn)入細(xì)胞周期所必需的[42,44]。另一方面，低氧會(huì)導(dǎo)致MTB內(nèi)部自由基(reactive oxygen species，ROS)代謝紊亂，對(duì)機(jī)體造成損傷；而PPP產(chǎn)生大量的NADPH，它以其強(qiáng)大的還原能力迅速清除ROS，實(shí)現(xiàn)氧化還原平衡，并且修復(fù)ROS造成的損傷[45]?？傊?，PPP可有效緩解低氧環(huán)境給MTB造成的損傷，并且為重新進(jìn)行復(fù)制狀態(tài)做好準(zhǔn)備。

五、展望

MTB的代謝網(wǎng)絡(luò)可以有效地對(duì)多種碳底物同時(shí)進(jìn)行分解代謝[5]，通過不斷地自我調(diào)節(jié)以適應(yīng)不斷變化的微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)MTB最佳生長狀態(tài)。代謝的多功能性已經(jīng)日益被認(rèn)為是一種重要的致病機(jī)制，如何在多變的環(huán)境下建立和維持慢性感染決定了MTB的致病性[46]。 MTB完整的糖代謝途徑對(duì)于維持MTB穩(wěn)態(tài)起著重要作用，對(duì)于這其中某一環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，可能會(huì)成為預(yù)防或治療結(jié)核病的有效途徑，為抗結(jié)核藥物的研發(fā)帶來了新的靶點(diǎn)。目前國內(nèi)外對(duì)MTB進(jìn)行糖代謝的研究仍然較少，這需要我們不斷的關(guān)注與探索。