孫翔翔，王 萍，劉蒙達(dá)，樊曉旭，孫世雄，張培培，田莉莉，孫明軍

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東青島 266100）

Q 熱是由伯氏柯克斯體（Coxiella burnetii）感染導(dǎo)致的一種自然疫源性人獸共患病，在全球分布廣泛，幾乎所有國(guó)家均有動(dòng)物感染的報(bào)道，包括牛、羊在內(nèi)的多種動(dòng)物均對(duì)其易感[1]。奶?；糛 熱后可通過(guò)胎盤(pán)、乳汁和糞尿等排出病原，或經(jīng)蜱蟲(chóng)叮咬傳播給其他動(dòng)物，主要表現(xiàn)體重下降、產(chǎn)奶量減少等癥狀，甚至出現(xiàn)流產(chǎn)和產(chǎn)死胎等現(xiàn)象，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2]。為了解該病在規(guī)模奶牛場(chǎng)的流行情況，在我國(guó)北方地區(qū)7 個(gè)規(guī)模奶牛場(chǎng)采集233 份奶牛血清進(jìn)行Q 熱抗體檢測(cè)，同時(shí)采集103 份棉拭子進(jìn)行Q 熱病原檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 奶牛血清和鼻腔棉拭子，采集自我國(guó)北方地區(qū)7 個(gè)規(guī)模場(chǎng)；Q 熱抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自IDEXX 公司；熒光定量PCR 試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.2 儀器 酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)TECAN 公司；實(shí)時(shí)定量熒光PCR 儀Quant Studio3，購(gòu)自Thermo Fisher 公司；各種型號(hào)移液器，購(gòu)自Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 血清學(xué)檢測(cè) 按照Q 熱抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用前將所有試劑恢復(fù)至室溫，并輕輕渦旋混勻；配制1×洗滌溶液；在每個(gè)微量反應(yīng)板的孔中，加入100 μL 已稀釋好的樣品；在2 個(gè)適當(dāng)孔，分別加入100 μL 未稀釋的陽(yáng)性對(duì)照，2 個(gè)適當(dāng)孔分別加入100 μL 未稀釋的陰性對(duì)照；使用微量板振蕩器充分混勻孔中內(nèi)容物，蓋上蓋板，37 ℃條件下孵育1 h；用300 μL 左右的洗滌溶液，對(duì)每個(gè)板孔洗滌3 次；每次洗滌后吸去每個(gè)板孔中的液體，最后一次甩板后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余液體；每孔加入100 μL 酶標(biāo)抗體，蓋上蓋板，37 ℃條件下孵育1 h；重復(fù)洗板步驟；每孔加入100 μL 底物溶液，室溫下避光孵育15 min；每孔加入100 μL 終止液，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板，測(cè)量并記錄樣品和對(duì)照在450 nm 波長(zhǎng)下的吸光值。陽(yáng)性對(duì)照OD 平均值不應(yīng)大于2.5，陰性對(duì)照OD 平均值不應(yīng)大于0.5，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照OD 差值應(yīng)大于0.3，試驗(yàn)方有效。S/P=（樣品OD 值-陰性對(duì)照平均OD 值）/（陽(yáng)性對(duì)照平均OD 值-陰性對(duì)照平均OD 值）×100%。S/P＜30%，判為陰性；30%≤S/P＜40%，判為可疑，需重新檢測(cè)；S/P≥40%，判為陽(yáng)性。

1.2.2 病原學(xué)檢測(cè) 采用《OIE 陸生動(dòng)物診斷與疫苗手冊(cè)》3.1.16 章推薦的熒光定量PCR 方法[3]。針對(duì)Q 熱病原IS1111特異性靶基因設(shè)計(jì)引物和探針（表1），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。熒光定量 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?yàn)椋?×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、探針 0.25 μL、ddH2O 8.25 μL；50 ℃2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)45 次。任意一孔陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果或任意一孔陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)陰性結(jié)果，提示本次熒光定量PCR 檢測(cè)無(wú)效，應(yīng)重新開(kāi)展檢測(cè)；Ct 值小于38，判為陽(yáng)性，大于38，判為陰性。

表1 Q 熱病原引物和探針信息

2 結(jié)果

在7 個(gè)規(guī)模場(chǎng)采集的233 份血清樣品中，共檢測(cè)到Q 熱抗體陽(yáng)性34 份，平均血清學(xué)陽(yáng)性率為14.59%；在采集的103 份棉拭子樣品中，檢測(cè)到Q 熱病原陽(yáng)性樣品12 份，平均病原學(xué)陽(yáng)性率為11.65%（表2）。

3 討論

本次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，7 個(gè)規(guī)模場(chǎng)均檢測(cè)到血清學(xué)陽(yáng)性，6 個(gè)場(chǎng)均檢測(cè)到病原陽(yáng)性，說(shuō)明Q 熱在我國(guó)北方規(guī)模場(chǎng)中流行較為廣泛。但不同規(guī)模場(chǎng)的流行情況并不一致，陽(yáng)性率介于3%～33%，提示可能處于不同的感染時(shí)期。規(guī)模場(chǎng)3 未檢測(cè)到病原核酸，但血清學(xué)陽(yáng)性率為12%，說(shuō)明可能曾有過(guò)感染；規(guī)模場(chǎng)4 未檢測(cè)到血清學(xué)陽(yáng)性，但病原學(xué)陽(yáng)性率為12%，提示可能處于感染初期；規(guī)模場(chǎng)6 病原陽(yáng)性率最高（33%），但血清學(xué)陽(yáng)性率卻較低（4%），提示可能處于感染初期的奶牛數(shù)量較多；規(guī)模場(chǎng)7 病原學(xué)陽(yáng)性率為18%，但血清學(xué)陽(yáng)性率卻高達(dá)32%，提示可能臨近感染末期。

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果 單位：份

Q 熱病原可通過(guò)氣溶膠感染人和動(dòng)物。國(guó)內(nèi)外均有Q 熱流行的報(bào)道[4]。上海市某規(guī)模牛場(chǎng)Q熱血清學(xué)監(jiān)測(cè)顯示，抗體陽(yáng)性率在35%以上[5]；新疆9 個(gè)地區(qū)的牛場(chǎng)中有6 個(gè)地區(qū)發(fā)現(xiàn)Q 熱，陽(yáng)性率約為30%[6]；甘肅省南部地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查顯示，56 份牛樣品中5 份為Q 熱抗體陽(yáng)性[7]；100 份青海牦牛血清中，檢測(cè)到27 份Q 熱抗體陽(yáng)性[8]。埃及流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道顯示，牛Q 熱抗體陽(yáng)性率約為19.3%[9]；加納部分地區(qū)牛Q 熱抗體陽(yáng)性率為21.7%[10]；斯洛文尼亞流行病學(xué)調(diào)查顯示，牛Q 熱血清學(xué)陽(yáng)性率高達(dá)46%[11]。本次檢測(cè)結(jié)果顯示，7個(gè)規(guī)模奶牛場(chǎng)均存在不同程度的、處于不同時(shí)期的伯氏柯克斯體感染，應(yīng)引起養(yǎng)殖場(chǎng)的高度重視，做好Q 熱的應(yīng)對(duì)工作，以防引起流產(chǎn)，甚至導(dǎo)致人員感染。

由于受采樣數(shù)量、采樣地區(qū)等的局限性影響，本次針對(duì)規(guī)模場(chǎng)奶牛的血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查結(jié)果并不能真實(shí)反映我國(guó)所有規(guī)模場(chǎng)的Q 熱流行情況，因此有必要加強(qiáng)Q 熱的流行病學(xué)調(diào)查研究，進(jìn)一步開(kāi)展監(jiān)測(cè)，掌握Q熱在畜間的真實(shí)流行病學(xué)資料，以控制該病的傳播。

此外，還應(yīng)加強(qiáng)Q 熱新型診斷技術(shù)研發(fā)[12]，為快速、特異和高效診斷該病提供技術(shù)支撐。