李欣宇，葉 鋒，鐘 旗，馬曉菁，謝彩云，易新萍，趙紅瓊，姚 剛，劉麗婭，谷文喜

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

安格斯牛原產(chǎn)于英國(guó)的阿伯丁、安格斯和金卡丁等郡，全稱為阿伯丁-安格斯牛[1]，因性成熟早、屠宰率高、肉品優(yōu)良、飼料轉(zhuǎn)化率高、犢牛成活率高、難產(chǎn)率低，成為育種的父本或母本。1980年以來，我國(guó)越來越多的省份通過大量引進(jìn)安格斯牛來改良當(dāng)?shù)仄贩N。新疆自1999 年開始逐漸引進(jìn)安格斯牛[2]。

牛病毒性腹瀉/黏膜?。╞ovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的，主要發(fā)生于牛的一種急性、熱性傳染病[3]；牛傳染性鼻氣管炎（bovine infectious rhinotracheitis，IBR）又稱壞死性鼻炎（necrotic rhinitis）、紅鼻?。╮ed nose disease），是由牛傳染性鼻氣管炎 病 毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的一種牛接觸性傳染病[4]。布魯氏菌?。╞rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的人獸共患傳染病[5]。BVD、IBR 和布魯氏菌病均可引起母畜流產(chǎn)，產(chǎn)畸形胎或免疫力低下犢牛等，臨床上很難治愈，可終身帶毒，引起患牛生產(chǎn)性能下降或死亡，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。為了解新疆當(dāng)?shù)亓餍幸卟?duì)引進(jìn)安格斯牛的影響，本研究選擇新引進(jìn)安格斯牛的育種場(chǎng)A 和原有安格斯牛的育種場(chǎng)B，開展了BVD、IBR 和布魯氏菌病的血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)，以期為安格斯牛養(yǎng)殖場(chǎng)的疫病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

A 場(chǎng)存欄安格斯牛2 922 頭，全部為8月齡左右的母牛，2018 年9月初從澳大利亞引入。該批安格斯牛引進(jìn)時(shí)，BVD、IBR 和布魯氏菌病檢測(cè)均為陰性，在隔離期間，全部進(jìn)行了IBRV 疫苗免疫，入場(chǎng)4 個(gè)月后，全群補(bǔ)免了BVDV 疫苗，同時(shí)加強(qiáng)免疫了IBRV 疫苗，未免疫布魯氏菌疫苗。A 場(chǎng)自安格斯牛引入后，再未引進(jìn)新牛及購(gòu)買凍精。B場(chǎng)總存欄安格斯牛370 頭，其中育成母牛216 頭、犢牛154 頭，為當(dāng)?shù)匾M(jìn)安格斯牛2 年以上牛場(chǎng)，常年購(gòu)買凍精進(jìn)行母畜繁殖，未免疫BVDV、IBRV 和布魯氏菌疫苗。

按照《動(dòng)物防疫抽樣規(guī)范》（DB11/T 677—2009）要求，按存欄量的5%隨機(jī)抽樣，尾靜脈采血，共采集170 份血樣，4 ℃保存，其中A 場(chǎng)150 份、B 場(chǎng)20 份。

1.2 主要儀器

微量移液器（型號(hào)TopPette），購(gòu)自北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；滅菌移液器槍頭（型號(hào)BT224-YS），購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；恒溫箱二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)BCJ80-S），購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PCR 擴(kuò)增儀（型號(hào)AG22331Hamburg），購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司。其他儀器：計(jì)時(shí)器、潔凈玻璃板、試管架等。

1.3 主要試劑

BVDV 抗原檢測(cè)試劑盒、IBRV gB 抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自IDEXX 公司；EasyPure Blood Genomic DNA Kit、ddH2O，購(gòu)自北京全氏金生物技術(shù)有限公司；2×PCRTaqPlus MasterMix with dye，購(gòu)自愛必夢(mèng)生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清稀釋液（0.5%石碳酸、0.85%NaCl），自行配制；布魯氏菌虎紅凝集抗原、布魯氏菌試管凝集抗原，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，購(gòu)自黑龍江省生物制品一廠。

1.4 檢測(cè)方法

對(duì)采集的全血分離血清，用BVDV 抗原ELISA 檢測(cè)試劑盒和IBRV gB 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒，分別進(jìn)行BVDV 抗原與IBRV 抗體檢測(cè)。對(duì)IBRV 抗體檢測(cè)陽(yáng)性的全部樣品，提取DNA，用特異性引物擴(kuò)增。用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）結(jié)合試管凝集試驗(yàn)（SAT）進(jìn)行布魯氏菌檢測(cè)。

1.4.1 IBRV 抗體ELISA 檢測(cè) 按照IBRV gB 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書操作。

1.4.2 IBRV 核酸PCR 檢測(cè) 將4 ℃抗凝血管中保存的樣品放置室溫，按照病毒液DNA 提取試劑盒說明書提取DNA。參考文獻(xiàn)[6]合成gI 引物：上游引物為5'-cggcggtcgagcggcaagag-3'，下游引物為5'-aggcgggaacacagctgggacaat-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為398 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系為：PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，用ddH2O 補(bǔ)至25 μL。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)摸索，確定PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4.3 BVDV 抗原ELISA 檢測(cè) 按照BVDV 抗原ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書操作。

1.4.4 布魯氏菌抗體檢測(cè) 采用RBT、SAT 方法，嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2018）操作。

2 結(jié)果

2.1 IBRV 抗體ELISA 檢測(cè)

A、B 場(chǎng)的170 份樣品全為IBRV 抗體陽(yáng)性，抗體陽(yáng)性率均為100%。

2.2 IBRV 核酸PCR 檢測(cè)

經(jīng)PCR 檢測(cè)，A 場(chǎng)未檢出IBRV 核酸陽(yáng)性，陽(yáng)性率為0；B 場(chǎng)檢出4 份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為20%（4/20）。陽(yáng)性樣品的PCR 檢測(cè)結(jié)果見圖1。

2.3 BVDV 抗原ELISA 檢測(cè)

A、B 場(chǎng)全部170 份樣品中，未檢出BVDV抗原陽(yáng)性，抗原陽(yáng)性率均為0。

圖1 B 場(chǎng)IBRV 陽(yáng)性樣品PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.4 布魯氏菌抗體檢測(cè)

A 場(chǎng)樣品布魯氏菌RBT 與SAT 法均未檢出陽(yáng)性，抗體陽(yáng)性率均為0；B 場(chǎng)RBT 法未檢出陽(yáng)性，SAT 法檢出1 份陽(yáng)性，抗體陽(yáng)性率為5%。

3 分析與討論

本研究對(duì)新疆養(yǎng)殖安格斯牛的A、B 兩個(gè)牛場(chǎng)進(jìn)行BVDV、IBRV 和布魯氏菌抗體和抗原檢測(cè)，結(jié)果在A 場(chǎng)未檢測(cè)出BVDV 抗原和布魯氏菌抗體，IBRV核酸檢測(cè)全為陰性，IBRV抗體檢測(cè)全為陽(yáng)性，說明該場(chǎng)新引進(jìn)的安格斯牛未感染BVDV、IBRV和布魯氏菌，IBRV 疫苗免疫效果良好；B 場(chǎng)已引進(jìn)安格斯牛2 年以上，一直未進(jìn)行過BVDV、IBRV 和布魯氏菌疫苗免疫，但其IBRV 抗體陽(yáng)性率為100%，IBRV 核酸PCR 陽(yáng)性率為20%，布魯氏菌抗體陽(yáng)性率為5%，說明該場(chǎng)存在IBRV 和布魯氏菌感染。

本次檢測(cè)在2 個(gè)牛場(chǎng)雖均未檢測(cè)到BVDV，所以存在較高的BVDV 感染風(fēng)險(xiǎn)，但因新疆地區(qū)的BVD、IBR 和布魯氏菌病流行狀況較為嚴(yán)重。2007 年郭燕[7]對(duì)新疆北疆部分集約化奶牛場(chǎng)進(jìn)行BVDV 分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均抗原陽(yáng)性率為35.4%；2019 年馬振國(guó)[8]對(duì)新疆地區(qū)5 833 份牛血清進(jìn)行BVDV 抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為52.03%。2012 年鄒世穎等[9]對(duì)我國(guó)北方六省市進(jìn)行IBR流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)4 個(gè)規(guī)模化牛場(chǎng)的IBRV 抗體陽(yáng)性率高達(dá)68%；2018 年張迎春等[10]對(duì)新疆南疆部分規(guī)模牛場(chǎng)進(jìn)行IBR 血清流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)規(guī)?；膛?chǎng)的IBRV 群抗體陽(yáng)性率高達(dá)100%。2012 年李玲等[11]對(duì)南北疆、十三地州13 個(gè)縣（市）的3 600 份牛血清進(jìn)行布魯氏菌抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為0.38%；2019 年齊姍姍[12]對(duì)新疆烏魯木齊縣的1 203 份奶牛血清進(jìn)行布魯氏菌抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為4.7%。

新引進(jìn)的安格斯牛經(jīng)進(jìn)境檢疫檢測(cè)，雖可以保證未感染BVDV、IBRV 和布魯氏菌，但引入后，因周邊存在這些疫病的流行，防控稍有松懈，就會(huì)引入病原。因此，建議牛場(chǎng)實(shí)施全群IBRV 和BVDV 疫苗免疫，篩選并淘汰持續(xù)感染（PI）牛；嚴(yán)格外購(gòu)凍精、胚胎的BVDV、IBRV 和布魯菌檢測(cè)；堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，慎重從場(chǎng)外引進(jìn)牛只。

4 結(jié)論

本研究對(duì)新引進(jìn)安格斯牛和引進(jìn)2 年以上安格斯牛的2 家牛場(chǎng)進(jìn)行BVDV、IBRV 和布魯氏菌病原學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)安格斯牛引進(jìn)后存在較大的BVDV、IBRV 和布魯氏菌感染風(fēng)險(xiǎn)，提示該地養(yǎng)殖場(chǎng)必須嚴(yán)格實(shí)施疫病防控措施，防止引進(jìn)牛群感染當(dāng)?shù)亓餍幸卟〔≡?/p>