楊靜竹，苗海生，陳云明，蔡高萍，譚 東，李亞琴，黃曉雨，李 樂(lè)，寇美玲，廖德芳，李華春

（1.臨滄市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南臨滄 677000；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224）

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的，主要侵害豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物的一種高度接觸性傳染病[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。FMDV 有7 個(gè)血清型，型間無(wú)交叉免疫保護(hù)。在東南亞國(guó)家，流行的FMDV 毒株主要有O 型的SEA/Mya-98、Cathay、ME-SA/PanAsia、ME-SA/Ind-2001d 毒株以及A 型的ASIA/Sea-97 毒株。其中ME-SA/Ind-2001d 毒株2015 年首次傳入老撾，隨后在越南、緬甸流行，2017 年初傳入我國(guó)新疆喀什地區(qū)[2-3]。Asia-1型流行的報(bào)告極少，近15年來(lái)，只有2017 年緬甸報(bào)道過(guò)G-VIII 毒株[4]。與我國(guó)接壤或鄰近的東南亞國(guó)家A、O 和Asia-1 型FMD 常年流行，動(dòng)物隱性帶毒情況較普遍。從分子流行病學(xué)分析結(jié)果來(lái)看，近年引起我國(guó)FMD 疫情的流行毒株均來(lái)源于東南亞國(guó)家，因此東南亞地區(qū)已成為傳入我國(guó)FMDV 的主要疫源地[5-7]。

臨滄市地處云南省西南部，轄1 個(gè)區(qū)7 個(gè)縣，其中鎮(zhèn)康、耿馬和滄源3 個(gè)縣與緬甸山水相連，國(guó)境線長(zhǎng)290.8 km（鎮(zhèn)康縣段96.36 km、耿馬縣段47.35 km 與緬甸禪邦第一特區(qū)果敢縣接壤，滄源縣段147.09 km 與緬甸佤邦第二特區(qū)接壤），有鎮(zhèn)康南傘、耿馬孟定清水河以及滄源永和3 個(gè)國(guó)家級(jí)口岸和數(shù)量眾多的邊境通道，邊民互通頻繁，畜牧業(yè)生產(chǎn)長(zhǎng)期處于頻繁互市與混牧狀態(tài)。因東南亞、南亞大多數(shù)國(guó)家存在FMD，國(guó)與國(guó)之間的正?；钚罅鲃?dòng)和畜產(chǎn)品正常貿(mào)易被嚴(yán)格禁止。但因國(guó)內(nèi)牛羊肉供需矛盾突出，價(jià)格逐年上漲，使得邊民跨境非法販運(yùn)活畜入境行為頻繁發(fā)生。加之，緬北地區(qū)戰(zhàn)事時(shí)有發(fā)生，大量牲畜隨邊民不斷涌入臨滄境內(nèi)，造成大量活畜非法頻繁跨境流動(dòng)，給臨滄市動(dòng)物疫病防控帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。為了解臨滄市邊境地區(qū)外來(lái)牛FMD 血清學(xué)背景，對(duì)2016—2019 年采自鎮(zhèn)康、耿馬和滄源3 個(gè)縣的入境牛血清1 688 份進(jìn)行了FMDV 血清抗體檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以評(píng)估當(dāng)?shù)厝刖撑MDV 血清抗體水平和傳入的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清采集 按照隨機(jī)抽樣原則，在云南省臨滄市鎮(zhèn)康、耿馬和滄源3 個(gè)縣中緬邊境采樣。每個(gè)縣先按采樣點(diǎn)所屬地理位置劃定采樣區(qū)域，再將劃定區(qū)域內(nèi)的養(yǎng)殖場(chǎng)、活畜交易市場(chǎng)和散養(yǎng)戶分別進(jìn)行編號(hào)，并隨機(jī)抽取養(yǎng)殖場(chǎng)2～3 個(gè)、活畜交易市場(chǎng)1 個(gè)、散養(yǎng)戶40～60 個(gè)。樣品采集由縣級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)實(shí)施，場(chǎng)群內(nèi)按飼養(yǎng)牛只的耳標(biāo)號(hào)，隨機(jī)選取采樣個(gè)體。2016—2019年，3 個(gè)縣共在168 個(gè)采樣點(diǎn)，累計(jì)采集牛血樣品1 688 份（表1）。將采集的血液樣品分離血清，56 ℃滅活30 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 2016—2019 年檢測(cè)點(diǎn)血液樣品的采樣數(shù)量及分布

1.1.2 主要試劑 FMDV O、A、Asia-1 型C-ELISA血清抗體檢測(cè)試劑盒，參照Mackay等[8]、Paiba等[9]的方法，由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院國(guó)家口蹄疫專業(yè)實(shí)驗(yàn)室（昆明）自行研制[10]；FMDV 非結(jié)構(gòu)蛋白抗體單抗阻斷ELISA 試劑盒，購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司和深圳真瑞生物技術(shù)有限公司；FMDV O、A、Asia-1 型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清，由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院國(guó)家口蹄疫專業(yè)實(shí)驗(yàn)室（昆明）提供。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 血清抗體檢測(cè) 采用 O、A、Asia-1 型C-ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)，各型試劑盒的操作方法相同，均參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果判定：當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD 值≥0.8，陰性對(duì)照孔平均OD 值≤0.3 時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立；抑制率≥40%判定為陽(yáng)性，抑制率＜40%判定為陰性。

1.2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè) 采用FMDV 非結(jié)構(gòu)蛋白抗體單抗阻斷ELISA 試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。結(jié)果判定：阻斷率=（陰性對(duì)照OD450平均值-樣品孔OD450平均值）/陰性對(duì)照OD450平均值×100%。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照OD450平均值≥55%、陰性對(duì)照OD450平均值-陽(yáng)性對(duì)照OD450平均值≥0.6時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立；被檢樣品阻斷率≥40%判定為陽(yáng)性，介于25%～40%判定為可疑，＜40%判定為陰性。

1.3 檢測(cè)結(jié)果分析

從血清型分布、時(shí)間分布、區(qū)域分布和群間分布等方面，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清型分布

血清型統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（表2）顯示：1 688 份血清樣品中，共檢出O 型抗體陽(yáng)性675 份，抗體陽(yáng)性率為39.99%；A 型抗體陽(yáng)性662 份，抗體陽(yáng)性率為39.22%；Asia-1 型抗體陽(yáng)性487 份，抗體陽(yáng)性率為28.85%。非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性345 份，抗體陽(yáng)性率為20.44%。

2.2 區(qū)域分布

區(qū)域統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）顯示：滄源縣采集血清樣品558 份，O、A、Asia-1 型抗體陽(yáng)性率分別為49.28%、56.27%、43.19%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為24.91%；耿馬縣采集血清樣品560 份，O、A、Asia-1 型抗體陽(yáng)性率分別為48.39%、44.64%、32.32%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為17.68；鎮(zhèn)康縣采集血清樣品570 份，O、A、Asia-1 型抗體陽(yáng)性率分別為22.63%、17.19%、11.40%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為18.77%?？傮w來(lái)看，滄源縣和耿馬縣抗體陽(yáng)性率相當(dāng)，但鎮(zhèn)康縣顯著偏低（P＜0.01）。

2.3 時(shí)間分布

時(shí)間分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示：2016—2019年3 個(gè)邊境縣的O、A 型抗體陽(yáng)性率總體呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），均由2016 年的15%左右上升到2019 年的40%以上；Asia-1 型抗體陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)，由2016 年的33%左右下降到2019 年的25%左右；非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率呈現(xiàn)波浪狀變化趨勢(shì)，2017 年降至7.56%，2018 年又上升至37.05%，2019 年再次下降到17.00%。

表2 2016-2019 年中緬邊境牛FMD 血清抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表3 3 個(gè)邊境縣2016—2019 年牛FMD 血清抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

2.4 群間分布

2.4.1 境內(nèi)牛和入境牛 累計(jì)檢測(cè)的1 688 份牛血清樣品包括入境牛血清樣品1 238 份、境內(nèi)牛450 份。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5）顯示：境內(nèi)牛O、A、Asia-1 型抗體陽(yáng)性率分別為44.89%、43.11%、33.33%，入境牛分別為38.21%、37.80%、27.22%，境內(nèi)牛顯著高于入境牛（P＜0.05）；境內(nèi)牛非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為7.56%，入境牛為25.12%，差異極顯著（P＜0.01）。

表4 2016—2019 年3 個(gè)邊境縣入境牛FMD 血清抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

2.4.2 黃牛與水牛 從入境牛的種屬來(lái)看，水牛O、A、Asia-1 型抗體陽(yáng)性率分別為63.08%、50.00%、29.20%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為26.92%；黃牛O、A、Asia-1 型抗體陽(yáng)性率分別為57.78%、35.93%、23.70%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為12.22%。水牛O、A 型抗體陽(yáng)性率以及非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率均高于黃牛（表6）。

3 討論

從血清學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果可以看出，2016—2019 年云南省臨滄市中緬邊境牛FMD 免疫水平不高，且存在一定的病毒感染，O、A、Asia-1 型和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體平均陽(yáng)性率介于20%～40%。東南亞國(guó)家大多經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)，部分國(guó)家并未實(shí)施強(qiáng)制免疫策略，導(dǎo)致FMD 免疫率低，而病毒感染率偏高。較高的非結(jié)構(gòu)蛋白抗體水平，說(shuō)明近期牛感染過(guò)病毒或隱性帶毒。鎮(zhèn)康縣和滄源縣2018 年入境牛非結(jié)構(gòu)蛋白抗體分別高達(dá)46.70%和40.00%，隱性帶毒風(fēng)險(xiǎn)極高，因此如何控制FMD 跨境傳播，是今后邊境地區(qū)FMD 防控面臨的難題。

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，邊境地區(qū)牛群中存在一定的Asia-1型抗體陽(yáng)性（28.85%），而多數(shù)東南亞國(guó)家多年來(lái)未報(bào)告發(fā)現(xiàn)Asia-1 型疫情。這其中除因免疫引起的抗體陽(yáng)性外，還有兩種可能：一是不同血清型的交叉免疫導(dǎo)致cELISA 檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性；二是Asia-1型FMDV在東南亞部分地區(qū)仍呈隱性流行。因此我國(guó)要警惕東南亞地區(qū)Asia-1 型的傳入。

2017 年O、A 型抗體陽(yáng)性率比2016 年均顯著上升，但非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率顯著下降，說(shuō)明云南省自2017 年獲批在云南邊境實(shí)施跨境動(dòng)物疫病區(qū)域化管理試點(diǎn)工作以來(lái)，通過(guò)建立FMD 控制區(qū)，指定入境通道，控制偶蹄活畜向控制區(qū)外流動(dòng)等措施，有效阻斷了FMD 的傳播，降低了傳入風(fēng)險(xiǎn)。但2018 年非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率明顯上升，這可能與國(guó)內(nèi)肉價(jià)上漲以及2018 年境外口蹄疫流行加重、地方武裝戰(zhàn)事等，導(dǎo)致大量活牛非法跨境輸入有關(guān)。

與入境牛相比，境內(nèi)牛O、A、Asia-1 型抗體陽(yáng)性率較高，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率較低，說(shuō)明境內(nèi)?？谔阋呙庖咝Ч詢?yōu)于入境牛，但不管是境內(nèi)牛還是境外牛，總體血清抗體陽(yáng)性率偏低，疫情發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高。當(dāng)然，Asia-1 型抗體陽(yáng)性率偏低也與我國(guó)2017 年Asia-1 型疫苗退出強(qiáng)制免疫計(jì)劃有關(guān)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，水牛的非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率高于黃牛，說(shuō)明水牛攜帶FMDV 的風(fēng)險(xiǎn)偏高，其原因有待探討。

表5 境內(nèi)牛和入境牛FMD 血清抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表6 入境水牛和黃?？谔阋哐蹇贵w檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

本次檢測(cè)僅采集入境牛樣本1 238 份、境內(nèi)牛450 份，樣本數(shù)量偏少，也不排除采樣時(shí)，部分散養(yǎng)戶提供信息不準(zhǔn)確等因素的存在，這些都會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)分析結(jié)果有偏倚。下一步可考慮增加境內(nèi)牛的樣本數(shù)量，采集有詳細(xì)背景信息的牛群。

4 結(jié)論

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，云南省臨滄市中緬邊境地區(qū)入境牛FMD 免疫水平較低，隱性帶毒率較高，存在較高的疫情傳入和發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。提議在邊境地區(qū)連續(xù)系統(tǒng)開(kāi)展FMD 病原學(xué)和血清學(xué)監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)免疫，提高免疫密度和抗體水平，同時(shí)嚴(yán)格監(jiān)控牛的非法跨境移動(dòng)，警惕FMD 傳入。