周丹丹 鄒秦文 林瑞超

摘要?目的：基于超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）技術(shù)對(duì)胃復(fù)春片的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了全面的研究，對(duì)主要化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒定。方法：采用Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm），以0.05%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相的梯度洗脫進(jìn)行分離。質(zhì)譜采用正、負(fù)離子檢測(cè)模式、全掃描及自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜掃描功能（Full MS/dd MS2）采集數(shù)據(jù)。通過(guò)化合物的最大紫外吸收波長(zhǎng)、精確相對(duì)分子質(zhì)量及二級(jí)碎片離子信息，與對(duì)照品的保留時(shí)間、mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比對(duì)，鑒定胃復(fù)春片的主要化學(xué)成分。結(jié)果：共鑒定出164種化學(xué)成分，其中包括人參皂苷類(lèi)42個(gè)、黃酮類(lèi)97個(gè)、二萜類(lèi)19個(gè)、其他6個(gè)。結(jié)論：UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確、較全面地鑒定胃復(fù)春片中化學(xué)成分，為明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及提升質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞?胃復(fù)春片;化學(xué)成分;UPLC-Q-Orbitrap HRMS;人參皂苷;黃酮;二萜

Abstract?Objective：Based on ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap mass spectrometry（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）technology，to thoroughly study the material basis of Weifuchun Tablets，and to quickly identify the main chemical components.Methods：The analysis was performed on a Thermo Hypersil GOLD C18 column（150 mm×4.6 mm，3 μm）.The mobile phase comprised of water containing 0.05% formic acid and acetonitrile was used for gradient elution.Mass spectrometry adopts positive and negative ion detection mode，full scan and automatic trigger secondary mass spectrometry scan function（Full MS/dd MS2）to collect data.By comparing the compound′s maximum ultraviolet absorption wavelength，accurate relative molecular mass and secondary fragment ion information with the reference substance retention time，mzVault 2.0 mass spectrometry database and related literature reports，the main chemical components of Weifuchun tablets were identified.Results：A total of 164 chemical constituents including 42 ginsenosides，97 flavonoids，19 diterpenoids and 6 other compounds，were identified.Conclusion：UPLC-Q-Orbitrap HRMS technology can quickly，accurately，and comprehensively identify the chemical composition of Weifuchun tablets，which provides a theoretical basis for clarifying the basic research of drug efficacy and improving quality standards.

Keywords?Weifuchun Tablet; Chemical Constituents; UPLC-Q-Orbitrap HRMS; Ginsenosides; Flavonoids; Diterpenoids

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.001

胃復(fù)春片收載于《中華人民共和國(guó)藥典》[1]2015年版一部，由紅參、香茶菜、麩炒枳殼3味中藥組成，臨床上主要用于慢性萎縮性胃炎、胃癌前期病變、淺表性胃炎、胃十二指腸潰瘍的治療[2]。中藥復(fù)方的化學(xué)成分研究有助于明確中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，是提升質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。目前，胃復(fù)春片中化學(xué)成分研究的報(bào)道較少。鐘靜華[3]采用HPLC-DAD-ESI-MSn以及HPLC/Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)胃復(fù)春片進(jìn)行分析，共鑒定出60個(gè)化學(xué)成分，初步明確了其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜技術(shù)具有多種質(zhì)譜掃描方式，其高靈敏度、高分辨率及高質(zhì)量準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)復(fù)雜的中藥復(fù)方中化學(xué)成分的篩查、識(shí)別和快速鑒定[4-5]。本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜，通過(guò)化合物的最大紫外吸收波長(zhǎng)、精確相對(duì)分子質(zhì)量及二級(jí)碎片離子信息，與對(duì)照品的保留時(shí)間和mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行匹配并參考相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，共鑒定出胃復(fù)春片中164個(gè)化學(xué)成分。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

超高效液相色譜儀（配有二元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、自動(dòng)控溫箱）通過(guò)HESI離子源與Q Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀鏈接，數(shù)據(jù)處理及采集軟件為Xcalibur 4.2（賽默飛世爾科技公司，美國(guó)，型號(hào)：UltiMate 3000-Q-Orbitrap）;電子天平（梅特勒-托多利儀器（上海）有限公司，型號(hào)：MS204TS/02）;超聲波清洗儀（Elma公司，德國(guó)，型號(hào)：P120H）：Milli-Q型超純水（Millipore公司，美國(guó)，型號(hào)：ADVANTAGE A10）。

1.2?試劑

對(duì)照品柚皮苷（批號(hào)：110722-201815）、橙皮苷（批號(hào)：110721-201818）、冬凌草甲素（批號(hào)：111721-201704）、人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-202028）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-201933）、20（S）-人參皂苷Rg2（批號(hào)：111779-200801）、人參皂苷Re（批號(hào)：110754-202028）、人參皂苷Rd（批號(hào)：111818-201603）、20（S）-人參皂苷Rg3（批號(hào)：110804-201504）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。人參皂苷Rh4（批號(hào)：174721-08-5）、人參皂苷Rg5（批號(hào)：186763-78-0）、人參皂苷Rk1（批號(hào)：494753-69-4）、人參皂苷Rk3（批號(hào)：364779-15-7）購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司;乙腈為HPLC級(jí)（美國(guó)Honeywell公司），甲酸為L(zhǎng)C-MS級(jí)（美國(guó)Fisher Scientific公司），其他為分析純（上海泰坦科技股份有限公司）。

1.3?分析樣品

胃復(fù)春片（批號(hào)：19066109）為杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司提供。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件

色譜柱為T(mén)hermo Hypersil GOLD C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）;柱溫：30 ℃;流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣體積：5 μL;DAD檢測(cè)190～400 nm。流動(dòng)相為0.05%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序如下：0～6 min，5%B→20%B;6～12 min，20%B;12～20 min，20%B→30%B;20～28 min，30%B→50%B;28～35 min，50%B→95%B;35～41 min，95%B→5%B。

質(zhì)譜條件：HESI離子源，正負(fù)離子掃描。鞘氣體積流量40 L/min;輔助氣體積流量10 L/min;噴霧電壓3.5 kV;離子傳輸管溫度320 ℃;輔助氣溫度350 ℃;掃描模式：Full MS/dd-MS2;正離子模式下一級(jí)掃描范圍m/z 150～1 500，負(fù)離子模式下一級(jí)掃描范圍m/z 100～1 500，分辨率70 000;AGC target為106，最大注入時(shí)間為100 ms，頂點(diǎn)觸發(fā)前五強(qiáng)的離子做MS2;二級(jí)掃描分辨率17 500，AGC target為105，最大注入時(shí)間為50 ms，Stepped NCE為10%、20%、30%。

2.2?對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取柚皮苷、橙皮苷、冬凌草甲素、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rh4、人參皂苷Rg1、20（S）-人參皂苷Rg2、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、20（S）-人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg5、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rk3對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成濃度約為50 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3?供試品溶液制備

取胃復(fù)春片20片，除去薄膜衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL后，稱(chēng)定重量，超聲（功率380 W，頻率37 kHz）提取45 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇溶液補(bǔ)足重量。搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm濾膜，即得。

2.4?結(jié)果

采用UPLC-Q-Orbitrap高分辨質(zhì)譜對(duì)胃復(fù)春片進(jìn)行化學(xué)成分研究。正負(fù)離子模式下得到的總離子流（TIC）色譜圖如圖1。紅參、枳殼和香茶菜的主要活性成分可為人參皂苷類(lèi)，黃酮類(lèi)和二萜類(lèi)化合物。根據(jù)不同類(lèi)型化合物的最大紫外吸收波長(zhǎng)可以把色譜峰進(jìn)行分類(lèi)：無(wú)紫外吸收的化合物為人參皂苷類(lèi);波長(zhǎng)在254～280 nm為黃酮及苷類(lèi);波長(zhǎng)在220～240 nm歸類(lèi)為二萜類(lèi)化合物。通過(guò)各類(lèi)化合物的質(zhì)譜裂解碎片分析、mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)篩查并結(jié)合對(duì)照品以及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，共鑒定出164種化學(xué)成分，包括42個(gè)人參皂苷類(lèi)、97個(gè)黃酮類(lèi)、19個(gè)二萜類(lèi)和6個(gè)其他化合物，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4.1?人參皂苷類(lèi)化合物的鑒定與分析?按照其母核骨架的不同，可以分為原人參二醇型（PPD）、原人參三醇型（PPT）、齊墩果酸型（OA）以及特殊類(lèi)型（如，擬人參皂苷F11、人參皂苷Rk1）等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18，23]，人參皂苷在負(fù)離子模式下具有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，其分子離子峰通常為[M+HCOO]-和[M-H]-。人參皂苷的糖苷鍵容易斷裂，失去相應(yīng)的中性碎片離子，如：162 Da（一分子的葡萄糖）、146 Da（一分子的鼠李糖）、132 Da（一分子的木糖或阿拉伯糖）等，最終生成苷元以及苷元上C-20位脫掉側(cè)鏈后的特征碎片離子。PPD型的特征離子為m/z 459 和m/z 375;PPT型的特征離子為m/z 475和m/z 391;OA型的特征離子為m/z 569和m/z 523。以峰105為例進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。峰105的保留時(shí)間為26.98 min，-ESI模式下的[M-H]-峰為m/z=784，連續(xù)脫去一分子鼠李糖和一分子葡萄糖生成m/z=637[M-H-Rha]-和m/z=475[M-H-Rha-Glu]-，以及苷元上C-20位脫掉側(cè)鏈后的碎片離子m/z=391[M-H-Rha-Glu-C6H12]-。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)測(cè)值784.496 7及元素組成分析，推測(cè)該化合物的分子式為C42H72O13（1.09 ppm）。通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間及質(zhì)譜圖的比較，確定該化合物為20（S）-人參皂苷Rg2，質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖2。

2.4.2?黃酮及其苷類(lèi)化合物的鑒定與分析?枳殼中主要含有二氫黃酮及苷類(lèi)和多甲氧基黃酮及苷類(lèi)等。二氫黃酮苷類(lèi)的糖苷鍵容易斷裂，其苷元的C環(huán)容易失去CO和氧原子，易發(fā)生RDA裂解，生成特征性離子[25]。以柚皮苷為例進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。峰40的tR為13.28 min，-ESI模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z=579[M-H]-，脫去糖鏈生成苷元m/z=271[M-H-Glu-Rha]-，再發(fā)生RDA裂解生成特征性碎片離子m/z=151[M-H-Glu-Rha-C8H8O]-。碎片離子m/z=459[M-H-C8H8O]-是由準(zhǔn)分子離子峰發(fā)生RDA裂解而生成。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)測(cè)值579.171 0及元素組成分析，推測(cè)該化合物的分子式為C27H32O14（0.33 ppm）。通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間及質(zhì)譜圖的比較，確定該化合物為柚皮苷，質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖3。

多甲氧基黃酮及苷類(lèi)化合物含有多個(gè)甲氧基，其質(zhì)譜裂解規(guī)律[26]主要為糖鏈的斷裂，失去多個(gè)CH3、中性分子H2O、CO以及RDA裂解。以橘皮素為例進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。峰148的tR為31.67 min，+ESI模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z=373[M+H]+，連續(xù)脫去3個(gè)CH3以及發(fā)生RDA裂解，分別生成m/z=358[M+H-CH3]+、m/z=343[M+H-2CH3]+、m/z=328[M+H-3CH3]+和m/z=211[M+H-3CH3-C9H8O]+。碎片離子m/z=343繼續(xù)脫去一分子CO、H2O以CH3，生成m/z=315[M+H-2CH3-CO]+、m/z=297[M+H-2CH3-CO-H2O]+、m/z=297[M+H-3CH3-CO]+的碎片離子。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)測(cè)值373.128 0及元素組成分析，推測(cè)該化合物的分子式為C20H20O7（-0.43 ppm）。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15，17]推測(cè)該化合物為橘皮素，質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖4。

2.4.3?二萜類(lèi)化合物的鑒定與分析?香茶菜中的主要化學(xué)成分為二萜類(lèi)化合物。以冬凌草甲素為例進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。冬凌草甲素在C-7位為一個(gè)半縮酮、C15位為一個(gè)酮羥基和多個(gè)羥基。因此，其質(zhì)譜裂解規(guī)律[14]主要為失去H2O、CO2、CO以及CH2O。峰59的保留時(shí)間為17.77 min，-ESI模式下的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z=363，脫去一分子CH2O生成m/z=333[M-H-CH2O]-。[M-H]-峰連續(xù)脫去2個(gè)分子的H2O以及一分子CO和一分子CO2，產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子m/z=345[M-H-H2O]-、m/z=327[M-H-2H2O]-、m/z=299[M-H-2H2O-CO]-和m/z=283[M-H-2H2O-CO2]-。此外，特征離子m/z=333連續(xù)脫去一分子H2O和一分子CO2生成m/z=315[M-H-CH2O-H2O]-和m/z=271[M-H-CH2O-H2O-CO2]-的碎片離子。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)測(cè)值363.180 9及元素組成分析，推測(cè)該化合物的分子式為C20H28O6（1.75 ppm）。通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間及質(zhì)譜圖的比較，確定該化合物為冬凌草甲素，質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖5。

3?討論

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap MS法對(duì)胃復(fù)春片中的主要化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒定。采用正、負(fù)離子同時(shí)掃描和Full MS/dd MS2模式采集數(shù)據(jù)。按照色譜峰的最大紫外吸收情況進(jìn)行分類(lèi)后，根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)碎片離子、質(zhì)譜裂解規(guī)律、mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)篩查以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)未知峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。在缺乏對(duì)照品的情況下，共鑒定了胃復(fù)春片中164個(gè)化學(xué)成分。研究表明，人參皂苷及其代謝產(chǎn)物具有顯著的抗腫瘤作用，尤其是人參經(jīng)蒸制成紅參后，轉(zhuǎn)化的新成分能夠加強(qiáng)抗腫瘤效果[27];香茶菜屬二萜多具有明顯的細(xì)胞毒活性、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，以及抗炎免疫作用[28];枳殼中的黃酮類(lèi)成分，尤其是二氫黃酮和多甲氧基黃酮類(lèi)，具有抗癌、腫瘤，抗微生物、抗炎性反應(yīng)等作用[29]。上述成分構(gòu)成胃復(fù)春片的復(fù)雜體系，通過(guò)多通路、多靶點(diǎn)、協(xié)同增效來(lái)發(fā)揮健脾益氣、活血解毒之功效。建立的UPLC-Q-Orbitrap法可快速、準(zhǔn)確地對(duì)胃復(fù)春片中的主要化學(xué)成分進(jìn)行鑒定分析，從而達(dá)到整體全面地控制與評(píng)價(jià)中藥復(fù)方的質(zhì)量，為明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了數(shù)據(jù)支持。

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（2020-06-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）