趙霞 李芝奇 徐玥 于夢(mèng)圓 張文婷 王昭懿 李朝峰 林瑞超 趙崇軍

摘要?目的：測(cè)定冰黃膚樂(lè)軟膏中無(wú)機(jī)元素的含量，提出重金屬元素的限量標(biāo)準(zhǔn)，為冰黃膚樂(lè)軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和中醫(yī)臨床用藥安全提供參考。方法：通過(guò)采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法對(duì)冰黃膚樂(lè)軟膏的無(wú)機(jī)元素進(jìn)行測(cè)定和分析。結(jié)果：建立了冰黃膚樂(lè)軟膏中24種無(wú)機(jī)元素的含量測(cè)定方法，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合藥典相關(guān)規(guī)定。結(jié)論：建立的冰黃膚樂(lè)軟膏無(wú)機(jī)元素檢測(cè)方法可行，為冰黃膚樂(lè)軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和臨床用藥安全提供參考。

關(guān)鍵詞?冰黃膚樂(lè)軟膏;無(wú)機(jī)元素;重金屬;含量測(cè)定;限量標(biāo)準(zhǔn)

Abstract?Objective：The content of inorganic elements in Binghuang Fule Ointment was determined，and a limit standard for heavy metal elements was proposed，which provided a reference for the improvement of the quality standard of Binghuang Fule Ointment and the safety of clinical medicine in traditional Chinese medicine.Methods：The inorganic elements of Binghuang Fule Ointment were determined and analyzed by microwave digestion-inductively coupled plasma mass spectrometry.Results：A method for determining the content of 24 inorganic elements in Binghuang Fule Ointment was established.The precision，stability，repeatability，and sample recovery test results all met the relevant provisions of the Pharmacopoeia.Conclusion：The established detection method for inorganic elements of Binghuang Fule Ointment is feasible，and it can provide a reference for the improvement of the quality standards of Binghuang Fule Ointment and the safety of clinical medication.

Keywords?Binghuang Fule Ointment; Inorganic elements; Heavy metals; Determination of content; Limited standard

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.003

冰黃膚樂(lè)軟膏處方是由大黃30 g、硫黃20 g、姜黃20 g、黃芩4 g、甘草4 g、冰片2 g和薄荷腦1.8 g組成[1]，主要用于治療濕疹、神經(jīng)性皮炎、銀屑病等癥，處方由7味中藥組成，包含礦物藥硫黃，復(fù)方中含有豐富的無(wú)機(jī)元素，有益微量元素協(xié)同作用發(fā)揮抗炎藥效。硫黃為冰黃膚樂(lè)軟膏的組分，化學(xué)成分主要是無(wú)機(jī)元素。硫黃As、Hg等重金屬元素超標(biāo)，但現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并未對(duì)重金屬進(jìn)行限量規(guī)定?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（2015年版）規(guī)定了大黃和姜黃的薄層色譜研究、冰片和薄荷腦的氣相色譜研究、硫黃的定性研究、大黃的含量測(cè)定[2]。文獻(xiàn)報(bào)道體外抗菌活性觀察[3]、治療神經(jīng)性皮炎的臨床觀察[4]、測(cè)定激素醋酸氟輕松[5]等研究，但采用微波消解-電感耦合等離子體法測(cè)定分析冰黃膚樂(lè)軟膏中的無(wú)機(jī)元素尚未有相關(guān)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)采用微波消解-電感耦合等離子體法對(duì)冰黃膚樂(lè)軟膏的無(wú)機(jī)元素進(jìn)行測(cè)定和分析，并提出重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)，完善冰黃膚樂(lè)軟膏的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICAP-RQ，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），New-Classic WF電子分析天平（梅特勒-托利多公司），微波消解儀（CEM MARS，美國(guó)CEM公司），電熱趕酸儀（H26841，恒奧德），Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。所有玻璃用品在使用前均需要在20%的硝酸溶液中浸泡24 h。

1.2?試劑

68.8%～69.8%Trace Metal級(jí)別硝酸（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;30%過(guò)氧化氫（AR）（國(guó)藥集團(tuán)）;超純水（Milli-Q超純水處理系統(tǒng)）;高純氬氣（氬氣體積分?jǐn)?shù)>99.999%）;ICP-MS用調(diào)諧液：Li、Ba、Bi、Ce、Co、In（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;元素[鋰（Li）、硼（B）、鈉（Na）、鎂（Mg）、鋁（Al）、磷（P）、鉀（K）、鈣（Ca）、鈦（Ti）、錳（Mn）、鐵（Fe）、鎳（Ni）、鋅（Zn）、鍶（Sr）、鋯（Zr）、鉬（Mo）、錫（Sn）、鋇（Ba）、銅（Cu）、砷（As）、鎘（Cd）、汞（Hg）、鉛（Pb）、鉻（Cr）]標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）;硼氫化鈉、氫氧化鉀、硫脲、抗壞血酸、鹽酸均為優(yōu)級(jí)純?cè)噭┵?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。微量元素標(biāo)準(zhǔn)溶液的批號(hào)：鋰（GSB 04-1734-2004）、硼（GSB 04-1716-2004）、鈉（GSB04-1738-2004）、鎂（GBW（E）083298）、鋁（GSB 04-1713-2004）、磷（GSB04-1741-2004）、鉀（GSB04-1733-2004）、鈣（GSB04-1720-2004）、鈦（GSB04-1757-2004）、（GSB04-1736-2004）、鐵（GSB04-1726-2002）、鎳（GSB 04-1740-2004）、鋅（GSB04-1761-2004）、鍶（GSB04-1754-2004）、鋯（GSB 04-1762-2004）、鉬（GSB04-1737-2004）、錫（GSB 04-1753-2004）、鋇（GSB 04-1717-2004）、銅（GBW08615）、砷（GBW08611）、鎘（GBW08612）、汞（GBW08617）、鉛（GBW08619）、鉻（GBW08614）均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。內(nèi)標(biāo)溶液：錸（GSB04-1745-2004）、釔（GSB04-1788-2004）、銠（GSB04-1746-2004）、銦（GSB04-1731-2004）、鈧（GSB04-1750-2004）均由國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心提供，1 000 μg/mL。

1.3?分析樣品

參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）自制冰黃膚樂(lè)軟膏4批次，藥材大黃（產(chǎn)地青海，批號(hào)：160926001）、姜黃（產(chǎn)地四川，批號(hào)：150318005）、黃芩（產(chǎn)地河北，批號(hào)：180611001）、甘草（產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號(hào)：18073002）、冰片（產(chǎn)地河南，批號(hào)：18094001）、薄荷腦（產(chǎn)地江蘇，批號(hào)：170612003）購(gòu)自北京同仁堂，硫黃購(gòu)自禹州市凱旋藥業(yè)有限公司。見表1。

2?方法與結(jié)果

2.1?ICP-MS工作條件及參數(shù)

ICP-MS儀器射頻功率：1 550 W;霧化室溫度：2.5 ℃;采樣深度5 mm;冷卻器流速14.0 L/min;輔助器流速0.801 2 L/min;霧化器流速1.064 1 L/min;蠕動(dòng)泵速率45 r/min;積分時(shí)間0.02 s;掃描次數(shù)：50次;重復(fù)次數(shù)：3次;掃描模式：KED模式。測(cè)定條件的優(yōu)化：儀器工作之前，進(jìn)行自動(dòng)調(diào)諧，設(shè)定工作參數(shù)，以靈敏度、背景、穩(wěn)定性等各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)儀器的工作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在ICP-MS檢測(cè)中，以Re、Rh、Y、In、Sc為內(nèi)標(biāo)，監(jiān)測(cè)信號(hào)的變動(dòng)情況，能有效克服儀器信號(hào)的漂移和校正基體效應(yīng)。在測(cè)定6種重金屬元素含量時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法監(jiān)控，其余18種無(wú)機(jī)元素采用外標(biāo)法直接測(cè)定。

2.2?對(duì)照品溶液的制備

內(nèi)標(biāo)：精密量取適量的錸（Re）、釔（Y）、銠（Rh）、銦（In）、鈧（Sc）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2%的硝酸稀釋配制成混標(biāo)濃度為10 μg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

外標(biāo)：精密量取Cr、As、Cu、Cd、Pb、Hg的標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，用2%的硝酸溶液稀釋配制成Cr、As、Cd、Pb（1、5、10、30、50 μg/L）;Cu稀釋成（10、50、100、300、500 μg/L）;Hg稀釋成（0.1、0.2、0.5、1、2 μg/L）的混標(biāo)溶液。

精密量取1 000 ppm的Na、P、Mg、Al、K、Ca適量，配制成含Na 5 ppm、P 5 ppm、Mg 20 ppm、Al 50 ppm、K 100 ppm、Ca 200 ppm的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備溶液1。

精密量取1 000 ppm的Fe、Mn、Ba適量，配制成含F(xiàn)e、Mn、Ba均為0.5 ppm的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液2。

精密量取1 000 ppm的B、Ni、Zn、Zr、Mo適量，配制成含B、Sc、Ni、Zn、Zr、Mo均為0.25 ppm的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液3。

精密量取1 000 ppm的Sn、Ti、Sr、Li適量，配制成含Sn、Ti、Sr、Li均為20 ppb的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液4。

將上述的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各取1 mL混勻，并用2%的硝酸溶液定容至10 mL，該溶液作為標(biāo)曲的最高點(diǎn)STD5。

取STD5溶液6 mL，用2%硝酸溶液定容至10 mL，該溶液作為STD4。

取STD5溶液2 mL，用2%硝酸溶液定容至10 mL，該溶液作為STD3。

取STD3溶液5 mL，用2%硝酸溶液定容至10 mL，該溶液作為STD2。

取STD2溶液2 mL，用2%硝酸溶液定容至10 mL，該溶液作為STD1。

除不加軟膏樣品外，其余制備方法與供試品溶液的制備方法相同，制成空白對(duì)照溶液。

2.3?供試品溶液的制備

取待測(cè)樣品約0.2 g，精密稱定，將樣品置于微波消解罐中，精確加入硝酸5 mL、雙氧水1 mL，在趕酸儀中預(yù)消解15 min，靜置室溫后加蓋密封，裝入微波消解儀中，按照設(shè)計(jì)程序。見表2。對(duì)樣品進(jìn)行微波消解。待消解完成后，冷卻至室溫，取出消解罐，在趕酸儀中110 ℃趕酸，趕酸至1～2 mL時(shí)，轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，用超純水洗滌微波消解罐數(shù)次，將洗滌液與試液合并定容至25 mL，作為供試品溶液。（Hg元素受熱易揮發(fā)，稀釋后直接測(cè)定，不趕酸）。

2.4?線性關(guān)系考察

6種重金屬元素測(cè)定時(shí)通過(guò)蠕動(dòng)泵線上隨行加入內(nèi)標(biāo)溶液，其余18種無(wú)機(jī)元素測(cè)定時(shí)不加內(nèi)標(biāo)液，直接用外標(biāo)法測(cè)定。在ICP-MS工作條件下，對(duì)24種元素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，以無(wú)機(jī)元素的3次離子計(jì)數(shù)平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取空白對(duì)照溶液進(jìn)行測(cè)試，進(jìn)樣11針，以空白對(duì)照溶液測(cè)定值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以相應(yīng)元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算該方法的檢出限，以空白對(duì)照溶液測(cè)定值的10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以相應(yīng)元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算該方法的定量限。見表3。

2.5?中間精密度試驗(yàn)

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“2.1”ICP-MS儀器工作條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄儀器標(biāo)準(zhǔn)品溶液各元素的濃度直讀數(shù)據(jù)，計(jì)算濃度的RSD值，結(jié)果以各元素濃度計(jì)。

除去Li元素，各元素RSD值均<8%，滿足15年版《中華人民共和國(guó)藥典》的要求，說(shuō)明儀器的精密度良好。見表4。

2.6?供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取R12的同一供試品溶液在0、1、2、3、4、5 h測(cè)定6次，記錄儀器供試品溶液的濃度直讀數(shù)據(jù)，結(jié)果以濃度計(jì)，計(jì)算濃度的RSD值。

各元素在5 h內(nèi)的RSD值均<8%，說(shuō)明供試品溶液的穩(wěn)定性良好，儀器連續(xù)測(cè)定5 h，穩(wěn)定性良好。見表5。

2.7?重復(fù)性試驗(yàn)

取編號(hào)R12的樣品，精密稱定，按照“2.2”供試品溶液的制備方法平行制樣6份，按照“2.1”ICP-MS儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。記錄儀器供試品溶液各元素的濃度直讀數(shù)據(jù)，計(jì)算R12樣品中各元素的含量及各元素含量的RSD值，結(jié)果以各元素的含量計(jì)。

除去Li元素，樣品中各元素平均含量重復(fù)性RSD值均<8%，符合15年版《中華人民共和國(guó)藥典》的要求，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。見表6。

2.8?回收率試驗(yàn)

取同一批已知元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的冰黃膚樂(lè)軟膏（R12）約0.1 g，將樣品置于微波消解罐中，加入適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液（多按照1∶1比例加標(biāo)準(zhǔn)品溶液，少數(shù)含量較低者加標(biāo)品至標(biāo)曲的中點(diǎn)位置），參照“2.2”供試品溶液的制備方法制備待測(cè)溶液，平行制樣6份。在“2.1”ICP-MS儀器工作條件下，測(cè)定，按照線性回歸方程計(jì)算各元素的加樣回收率。

除去Sr以外，各元素的平均回收率在70%～126%之間，回收率的RSD值在4.39%～14.34%之間，符合國(guó)家藥典的要求，因此該方法適用于冰黃膚樂(lè)軟膏此24種微量元素的檢測(cè)。見表7。

2.9?樣品測(cè)定結(jié)果

取23批不同批次的冰黃膚樂(lè)軟膏樣品，按照“2.2”供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，平行制樣2份，按照“2.1”ICP-MS儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次。

具體結(jié)果見表8。結(jié)果表明：冰黃膚樂(lè)軟膏中含有6種重金屬元素，Cr含量最高，在0.061 4～1.918 6 mg/kg之間;其次是Cu，含量在0.214 0～1.622 8 mg/kg之間;最后是As、Cd、Pb、Hg，含量均在0.1 mg/kg以下。18種無(wú)機(jī)元素含量相差較大，元素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)100 μg/kg的有4種，按由高至低的順序排列依次為：K>Ca>P>Al;平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)10 μg/kg的元素有3種，分別為Mg、Na、Fe;剩余11種元素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)均<10 μg/kg。

2.10?無(wú)機(jī)元素指紋圖譜的建立

根據(jù)23批冰黃膚樂(lè)軟膏各元素的含量檢測(cè)結(jié)果。見表8。參考文獻(xiàn)利用OriginPro8.5軟件處理數(shù)據(jù)[6-8]，建立冰黃膚樂(lè)軟膏的24種無(wú)機(jī)元素分布特征圖譜，按照原子序數(shù)順序制作含量分布曲線。為了便于觀察，將元素?cái)U(kuò)大或縮小一定的倍數(shù)至同一數(shù)量級(jí)。見圖1。根據(jù)無(wú)機(jī)元素含量測(cè)定結(jié)果及無(wú)機(jī)元素對(duì)比圖，確定共有元素有21種。取21種共有元素的相對(duì)平均值建立平均數(shù)對(duì)照?qǐng)D譜。見圖2。冰黃膚樂(lè)軟膏中各無(wú)機(jī)元素峰形相似，樣品批次，原料藥雖然有差異，但是各無(wú)機(jī)元素含量的多寡順序趨于一致，因此無(wú)機(jī)元素平均值所作的分布圖譜可作為冰黃膚樂(lè)軟膏的無(wú)機(jī)元素平均數(shù)對(duì)照指紋圖譜，為冰黃膚樂(lè)軟膏的鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。無(wú)機(jī)元素分布圖譜可以直觀分析各批次間的差異，有利于廠家從原料藥、制劑生產(chǎn)工藝等方面進(jìn)行質(zhì)量控制;廠家可根據(jù)無(wú)機(jī)元素分布圖譜判斷樣品的均一性、穩(wěn)定性，并對(duì)各批次樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，建立可追蹤溯源的長(zhǎng)期質(zhì)控圖，維持藥品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

3?討論

3.1?前處理方法和內(nèi)標(biāo)元素的選擇

前處理方法的選擇，本試驗(yàn)所采用的樣品前處理方法是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的微波消解法，該方法密閉高溫消解，處理樣品迅速，操作簡(jiǎn)便，節(jié)約試劑、空白對(duì)照溶液檢出限低、樣品制備過(guò)程待測(cè)元素?fù)]發(fā)少，引入外部污染概率小等優(yōu)點(diǎn)，程序升溫可以精準(zhǔn)控制溫度，以此方法處理樣品較為理想[9-10]。

3.2?微波消解程序的考察

微波消解程序主要影響因素為溫度、時(shí)間、功率?？疾熳罡邷囟?60、180、190、200 ℃，保持時(shí)間5、10、20、30 min，功率800、1 600 W條件下樣品消解情況，最終選擇溫度190 ℃、時(shí)間20 min、功率1 600 W為最優(yōu)程序升溫條件。

3.3?重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)分析

重金屬元素是評(píng)價(jià)中藥飲片安全性的重要指標(biāo)，參考GB 2762—2012食品標(biāo)準(zhǔn)中水產(chǎn)動(dòng)物及乳制品Cr含量較高為2 mg/kg，加拿大藥典規(guī)定草藥材Cr不得超過(guò)0.2 mg/kg，美國(guó)藥典規(guī)定飲食補(bǔ)充劑原料Cr6+不得超過(guò)2 mg/kg[11]，應(yīng)增加Cr元素的限量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)元素的含量測(cè)定結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)提出冰黃膚樂(lè)軟膏限量標(biāo)準(zhǔn)為Cr 2 mg/kg、Cu 20 mg/kg、As 2 mg/kg、Cd 0.3 mg/kg、Pb 5 mg/kg、Hg 0.2 mg/kg。

4?結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法成功測(cè)定了23批冰黃膚樂(lè)軟膏中24種無(wú)機(jī)元素的含量，該方法精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，檢出限低、靈敏度高，線性范圍寬，可用于冰黃膚樂(lè)軟膏中24種無(wú)機(jī)元素的定量分析。冰黃膚樂(lè)軟膏中重金屬元素量符合我國(guó)安全性相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)提出冰黃膚樂(lè)軟膏限量標(biāo)準(zhǔn)為Cr 2 mg/kg、Cu 20 mg/kg、As 2 mg/kg、Cd 0.3 mg/kg、Pb 5 mg/kg、Hg 0.2 mg/kg。

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（2020-06-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）