張云 楊卉 何軒輝 吳廣均 李軍

摘要?目的：用網絡藥理學方法探討麻杏石甘湯成分、靶點、通路和生物學功能，闡明其治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）細胞因子風暴的作用機制。方法：通過TCMSP、TCMID數(shù)據庫以及文獻報道，搜索麻杏石甘湯每味中藥的成分和靶點，用Cytoscape軟件構建和成分-靶點網絡。用STRING搜素靶點的相關蛋白，并構建PPI網絡。利用MECODE和ClusterOne聚類找出二者共同的關鍵靶點。利用Metascape和ClueGO對關鍵靶點進行通路和生物學功能富集分析。結果：麻杏石甘湯中麻黃有效成分6個、苦杏仁8個、石膏3個、生甘草92個。聚類分析得到67個關鍵靶點，其中IL-6和TNF是重要的核心靶點。麻杏石甘湯主要參與的分子通路和生物學功能與病毒感染和細胞因子免疫調節(jié)相關的是：人T細胞白血病病毒1型（TLV-1）感染;單純皰疹病毒感染;TNF-R1信號通路和相關信號復合物;整合素1途徑;白細胞介素信號;TH17細胞分化;炎性反應的調節(jié);PI3K-Akt信號通路;白細胞介素-2介導的信號通路;免疫應答中細胞因子分泌的負調控;內皮屏障建立的調控;T細胞穩(wěn)態(tài)增殖的調控。結論：麻杏石甘湯通過多成分、多靶點對機體的病毒感染和免疫炎性反應起到多方面的調控，包括促進TH細胞分化和T細胞穩(wěn)態(tài)抑制病毒復制，負調控白細胞介素、TNF、整合素等免疫炎性反應遞質消除細胞因子風暴。麻杏石甘湯針對COVID-19的病毒復制和細胞因子風暴具有顯著的調節(jié)作用。

關鍵詞?麻杏石甘湯;新型冠狀病毒肺炎;細胞因子風暴;網絡藥理學

Abstract?Objective：To discuss the composition， targets， pathways and biological functions of Maxing Shigan decoction and explore its curative mechanism of on COVID-19 cytokine storm by using network pharmacology. Methods：The components and targets of each Chinese herbal medicine of Maxing Shigan Decoction were searched through TCMSP and TCMID database， and literatures. The component target network was constructed by using the Cytoscape software. The PPI network was constructed by searching the protein related to the target in STRING database. MECODE and ClusterOne clustering software were used to find the common key targets. Metascape and ClueGo software were used to analyze the pathway and biological function enrichment of key targets. Results：In Maxing Shigan decoction， ephedra has 6 effective components， bitter apricot seed 8， gypsum 3 and liquorice root 92. Among the 67 key targets obtained by cluster analysis， IL6 and TNF are important core targets. The main molecular pathways and biological functions of Maxing Shigan decoction related to virus infection and cytokine immunoregulation are：HTLV-1 （human T-cell leukemia virus type 1） infection; herpes simplex virus infection; TNF-R1 signal pathway and related signal complexes; integrin 1 pathway; interleukin signal; Th17 cell differentiation; regulation of inflammatory response; PI3K Akt signaling pathway; interleukin-2-mediated signaling pathway; negative regulation of cytokine secretion in immune response; regulation of endothelial barrier establishment; regulation of T cell homeostatic proliferation. Conclusion：Based on network pharmacology， Maxing Shigan decoction can regulate virus infection and immune inflammatory response in many aspects through multi-component and multi-target， including promoting TH cell differentiation and T cell homeostatic proliferation to inhibit virus proliferation， and negatively regulating immune inflammatory factors such as interleukin， TNF， integrin to eliminate cytokine storm. Maxingshigan decoction has a significant regulatory effects on COVID-19 virus replication and cytokine storm. This study clarified the mechanism of the treatment of new coronary pneumonia with Lianhuang Qingwen， Jinhua Qinggan， Qingfei Paidu decoction and other prescriptions based on Maxing Shigan from one aspect， and provided a scientific basis for clinical rational drug use.

Keywords?Maxingshigan Decoction; COVID-19; Cytokine storm; Network pharmacology

中圖分類號：R289.4文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.011

新型冠狀病毒（COVID-19）已經造成世界大流行，給人類生命健康帶來巨大挑戰(zhàn)。李蘭娟等提出了“細胞因子風暴”又稱“炎癥風暴”概念。指出細胞因子風暴可能是COVID-19感染者由輕癥進展成重癥的主要病理機制之一[1]。細胞因子風暴是機體免疫反應過度造成的多器官損傷，如急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、代謝性酸中毒和出凝血功能障礙及多器官衰竭狀態(tài)。目前西藥治療細胞因子風暴有激素和IL-6受體阻斷劑托珠單抗，均取得了一定的臨床療效[2]。但同時也存在著很多不確定的不良反應。在本次新冠肺炎的救治過程中，中醫(yī)藥發(fā)揮了積極作用，尤其是能阻斷輕癥患者向重癥轉化。麻杏石甘湯是中醫(yī)治療肺炎的經典名方，具有辛涼宣泄，清肺平喘之功。我國第七版新冠肺炎防治指南重點提到的金花清感顆粒、連花清瘟膠囊、清肺排毒湯、化濕敗毒方都是在麻杏石甘湯的基礎上化裁而成。對重慶市萬州區(qū)集中收治的225例新型冠狀病毒肺炎患者的用藥情況分析，發(fā)現(xiàn)中藥干預參與率達87%（195例），主要選方是麻杏石甘湯（20.29%）[3]。我們推測麻杏石甘湯是通過抑制細胞因子風暴阻斷新冠肺炎患者由輕癥向重癥轉化。我們將采用網絡藥理學和生物信息學技術加以分析和闡釋。

1?資料與方法

1.1?資料來源?利用TCMSP數(shù)據庫[4]檢索并篩選麻黃、苦杏仁、生石膏、生甘草的有效成分，篩選條件為：藥物口服生物利用度（OB）值≥30%、藥物相似度（DL）值≥0.18。生石膏數(shù)據庫均無成分和靶點記錄，通過查找文獻[5]獲得有效成分和靶點。

1.2?方法

1.2.1?有效成分作用靶點的預測?通過Drugbank、Pubchem查找成分的證實作用靶點，通過SEA、Swiss Target Prediction數(shù)據庫進行靶點的預測。利用Cytoscape構建藥物-成分-靶點相互關系網絡圖。

1.2.2?利用UniProt數(shù)據庫對麻杏石甘湯的作用靶點進行標準化處理?利用String數(shù)據庫將麻杏石甘湯的所有作用靶點的相關蛋白進行檢索，選取score>0.95的相關蛋白生成PPI網絡圖。運用Cytoscape軟件的插件MECODE（選取SCORE>5的聚類）和ClusterOne（選取P<0.01的聚類）對麻杏石甘湯的作用靶點的PPI網絡圖進行聚類分析。將MECODE和ClusterOne選取的基因和蛋白進行取交集，作為核心基因和蛋白進行通路和功能分析。

1.3?統(tǒng)計學方法

運用Cytoscape軟件的插件ClueGO和Metascape對聚類分析得到的核心基因和蛋白進行通路和生物學功能分析，要求P<0.01。

2?結果

2.1?麻杏石甘湯各組成中藥的有效成分?經過ADME篩選，得到麻黃有效成分6個、苦杏仁有效成分8個、石膏有效成分通過文獻查找獲得3個、生甘草有效成分92個。見表1。

2.2?麻杏石甘湯各中藥有效成分的作用靶點?通過有效成分查找作用靶點發(fā)現(xiàn)麻黃作用靶點142個、苦杏仁作用靶點65個、石膏作用靶點2個、生甘草作用靶點388個。刪除重復靶點后，麻黃和苦杏仁有28個共同作用靶點，麻黃和生甘草有97個共同作用靶點，苦杏仁和生甘草有37個共同作用靶點，說明麻杏草（三拗湯）三藥具有顯著的協(xié)同作用。見圖1A。石膏的研究很少，靶點相對獨立。麻杏石甘湯各中藥有效成分及作用靶點相互關系網絡圖。見圖1B。

2.3?麻杏石甘湯各中藥有效成分作用的67個核心靶點?麻杏石甘湯各中藥有效成分作用靶點的PPI網絡圖見771 NODES，349 004 shortest PATHs。見圖2A。MECODE聚類分析得到85個關鍵靶點，ClusterONE聚類分析得到486個關鍵靶點，二者交集共有67個核心靶點。見圖2B以及67個核心靶點的內部相互作用關系網絡圖。見圖2C。從圖中可以看出IL6和TNF是重要的核心靶點。

2.4?麻杏石甘湯參與的主要通路和生物學功能分析結果?MetaScape分析結果表明，麻杏石甘湯主要參與和介導的分子通路是：胰島素樣生長因子轉運和攝取的調節(jié);人T細胞白血病病毒1型感染;TNF-R1相關信號復合物;整合素1途徑;細胞周期;白細胞介素信號;單純皰疹病毒感染;TH17細胞分化;細胞周期檢查點;炎性反應的調節(jié);PI3K-Akt信號通路;TNR-R1信號通路;配體刺激CBP-RARA-RARX-DNA通路;白細胞介素-2介導的信號通路;水解酶活性的負調控。見圖3。ClueGo分析發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯主要參與的生物學功能是：免疫應答中細胞因子分泌的負調控;端粒酶催化核心復合物組裝的正調控;內皮屏障建立的調控;內胚層細胞分化的負調控;足體組裝的正調控;T細胞穩(wěn)態(tài)增殖的調控。見圖4。

3?討論

細胞因子風暴在新型冠狀病毒疾病發(fā)展過程中常導致急性呼吸窘迫、多器官功能衰竭等加重病情。細胞因子風暴是指多種炎性反應遞質如白細胞介素家族、腫瘤壞死因子、選擇素、黏附素等的過高表達。尤其是IL-6、TNF-α的迅速大量產生打破了免疫平衡[5]。目前西醫(yī)除了采用糖皮質激素和托珠單抗以外，恢復期血漿[6]、間充質干細胞[7]、血液凈化、體外膜肺氧合等技術在一定程度上減輕了細胞因子風暴，但難以普及。新冠肺炎屬中醫(yī)的“疫病”，基本病機為疫毒外侵，早期表現(xiàn)為寒、濕、毒侵肺，中晚期可能涉及濕、熱、毒、瘀、虛。病情發(fā)展至細胞因子風暴階段常出現(xiàn)熱毒閉肺、毒瘀互結[8]和濕熱化毒、郁遏氣機[9]。麻杏石甘湯是辛涼宣肺、清肺平喘的經典名方，恰中病機。我們利用網絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯對新冠病毒及其細胞因子風暴具有多靶點的免疫調節(jié)作用。

我們發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯重點調節(jié)的67個關鍵靶點中IL-6和TNF是重要的核心靶點。麻杏石甘湯主要參與的分子通路和生物學功能主要與病毒感染和細胞因子免疫調節(jié)相關。如人T細胞白血病病毒1型感染;單純皰疹病毒感染;TNF-R1信號通路和相關信號復合物;整合素1途徑;白細胞介素信號;TH17細胞分化;炎性反應的調節(jié);PI3K-Akt信號通路;白細胞介素-2介導的信號通路;免疫應答中細胞因子分泌的負調控;內皮屏障建立的調控;T細胞穩(wěn)態(tài)增殖的調控。從網絡藥理學角度看，麻杏石甘湯通過促進Th細胞分化和T細胞穩(wěn)態(tài)抑制病毒復制，通過對白細胞介素、TNF、整合素等免疫炎性反應遞質的負調控消除細胞因子風暴。病毒感染和細胞因子風暴常常并存[10]。麻杏石甘湯對多種病毒感染和細胞因子風暴具有抑制作用。我國全面推廣的治療新冠肺炎的三藥三方中有4種（清肺排毒方、化濕敗毒方、金花清感顆粒、連花清瘟膠囊）都是在麻杏石甘湯的基礎上化裁而成。最新研究表明連花清瘟可以在體外抑制新型冠狀病毒活性并顯著改善新冠肺炎患者臨床癥狀[11]。因此，我們認為麻杏石甘湯針對COVID-19的病毒復制和細胞因子風暴具有顯著調節(jié)作用。同時我們也主張針對不同地域、體質、年齡的患者要根據辨證論治的原則可以在麻杏石甘湯的基礎上進行加減化裁治療，以取得個體化最優(yōu)診療方案。

本研究還存在不足之處。麻杏石甘湯中麻黃和石膏配伍能辛涼宣肺，麻黃、石膏和杏仁配伍能清肺平喘。麻杏石甘湯中石膏的作用不容忽視，但由于目前針對石膏的有效成分和作用靶點的研究都非常少。隨著對石膏研究的深入，麻杏石甘湯治療病毒性肺炎的更多機制將得到闡釋。

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（2020-04-20收稿?責任編輯：楊覺雄）