熊瑋 曾玉蘭 周薇

有研究表明,COPD早期階段病人和沒有氣流受限的吸煙者均可發(fā)生肺血管改變[1]。肺血管重塑過程分子機(jī)制復(fù)雜，其中TGF-β1在血管張力和增殖的控制上扮演著重要角色[2]。Th17細(xì)胞是一種擁有獨(dú)立分化機(jī)制的新型 CD4+效應(yīng) T 細(xì)胞，在COPD、哮喘等慢性炎癥性疾病和多種自身免疫性疾病中均有重要作用。IL-17是 Th17 細(xì)胞的主要效應(yīng)因子。已有研究證明，低壓低氧可致Th17細(xì)胞在肺組織中增多，在肺血管與心肌結(jié)構(gòu)重塑中發(fā)揮重要作用[3]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和IL-6共同作用，誘導(dǎo)了Th17細(xì)胞的分化。Smads蛋白家族參與TGF-β1的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中Smad2/3是TGF-β通路信號(hào)下傳的第一個(gè)信號(hào)分子。本研究通過建立香煙煙霧暴露大鼠模型進(jìn)行觀察，并進(jìn)一步加入藥物干預(yù)，以期探討IL-17、TGF-β1及TGF-β/Smad通路在肺血管重塑中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)健康雄性 7周齡SD大鼠72只，體質(zhì)量(210±10)g(由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng));CY-100B 數(shù)字測氧儀，兔抗 TLR-4 多克隆抗體、小鼠抗PCNA 單克隆抗體、PV600免疫試劑盒(武漢谷歌生物公司);奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司);HMIAS-2000 彩色圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽浼皠?dòng)物分組 參照文獻(xiàn)[4]制備大鼠被動(dòng)吸煙裝置，煙熏箱大小為 100 cm×65 cm×45 cm，每側(cè)各留9個(gè)直徑2.5 cm的通氣孔。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d無異常后隨機(jī)分為對(duì)照組(S1組)、煙霧暴露組(S2組)、煙霧暴露+藥物干預(yù)組(S3組)，每組各 24只。S1組大鼠置于小鐵籠內(nèi)，自由呼吸空氣，除常規(guī)喂養(yǎng)外不做其他處理；S2、S3組大鼠在規(guī)定煙霧暴露時(shí)間內(nèi)放置于煙熏箱內(nèi)，每次使用10支香煙捆扎為一組后點(diǎn)燃并置于煙熏箱中的支架上，香煙采用武漢市售紅金龍牌香煙，每支焦油含量為15 mg。用 CY-100B數(shù)字測氧儀進(jìn)行監(jiān)測，煙熏箱中的氧濃度保持在 20%～21%之間，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果開放煙熏箱的通氣孔；大鼠每天煙霧暴露2次，每次30 min，2次暴露時(shí)間間隔4 h。香煙煙霧暴露間隔期間將大鼠置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng)，任其自由活動(dòng)、飲食。同時(shí)，S3組大鼠于第5周起每次煙熏后腹腔注射Smad3抑制劑SB431542，2次/d，直至第12周。Smad3抑制劑(SB431542)以二甲基亞砜(DMSO)溶解，使用前將SB431542溶解在2%DMSO+30%聚乙二醇300+雙蒸水中，濃度為5 mg/mL，每次使用劑量為5 mg/kg，2次/d。如出現(xiàn)死亡則終止實(shí)驗(yàn)。S1、S2、S3組分別于第8周、第12周隨機(jī)處死12只大鼠。

1.3 病理標(biāo)本制作 各組大鼠到達(dá)造模時(shí)間干預(yù)點(diǎn)后，用1%戊巴比妥鈉(90 mg/kg)進(jìn)行麻醉，眼球取血法取血，制備血清。放血處死后開胸，分離出肺臟，取左肺用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，行石蠟包埋，病理切片機(jī)切片，切片厚度約4μm。

1.4 肺血管蘇木精-伊紅(HE)染色及病理學(xué)觀察 病理切片用HE染色法染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺泡和肺血管的病理學(xué)情況，每張切片隨機(jī)選取結(jié)構(gòu)較完整、橫斷面較圓且直徑約為50～200μm 的肺動(dòng)脈 5 支，分別測量內(nèi)外徑、血管面積及管壁厚度，以圖文分析儀測量并記錄管壁面積/血管總面積(vascular wall area/total vascular area，WA%)和血管壁厚度/血管外徑(vascularwall thickness/vascular external diameter，WT%)。

1.5 IL-17檢測 采用免疫組化法檢測大鼠肺組織中IL-17表達(dá)水平，ELISA法測定血清中 IL-17 的含量。IL-17免疫組化試劑盒均由美國 Santa Cruz 公司生產(chǎn)。IL-17一抗為山羊抗大鼠 IL-17 單克隆抗體，1∶70稀釋。陰性對(duì)照均用PBS代替。染色步驟按說明書進(jìn)行。以顯微鏡400倍視野下，隨機(jī)5個(gè)視野陽性染色積分光密度(IOD)均值反映IL-17表達(dá)量。

1.6 Smad3檢測 采用免疫組化法檢測肺組織中Smad3的表達(dá)水平，用鏈霉親和素過氧化物酶 (SP)法進(jìn)行。微波加熱法修復(fù)抗原，DAB顯色。試劑盒購自博士德生物制品有限公司，Smad3抗體濃度為1∶200。以5個(gè)視野IOD均值反映Smad3表達(dá)量。

1.7 TGF-β1檢測 采用PV6000二步法免疫組化染色法檢測肺動(dòng)脈組織TGF-β1的表達(dá)水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，每張切片在 400 倍視野下隨機(jī)采集5條直徑100～200μm的動(dòng)脈，采集圖像，測定每個(gè)視野下陽性染色動(dòng)脈的吸光度(A)，進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物的一般情況 實(shí)驗(yàn)開始前，各組動(dòng)物活動(dòng)、飲食情況良好，活動(dòng)敏捷。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中未見死亡小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每日給予充足定量飼料，觀察每日飼料剩余量。與S1組比較，8 周及12周時(shí)，S2動(dòng)物活動(dòng)度明顯下降，反應(yīng)遲鈍、飲食量下降；S3組活動(dòng)度下降，反應(yīng)遲鈍，飲食量下降，但較S2組程度減輕。

2.2 HE染色觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)改變 對(duì)照組肺動(dòng)脈壁較薄，結(jié)構(gòu)正常。S2組及S3組隨煙霧暴露時(shí)間延長，氣道和血管周圍炎性細(xì)胞浸潤逐漸加重，肺血管壁逐漸增厚。但未見肺氣腫改變。見圖1。

肺血管重塑定量分析觀察指標(biāo)：S1組8周與12周的WA%和WT%值無明顯差異。S2組8周和12周的WT%、WA%值均較同期S1組顯著增加，S2組12周時(shí)肺動(dòng)脈壁厚度明顯大于8周時(shí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。S3組8周及12周時(shí)的WA%和 WT%值分別高于同期S1組，但低于同期S2組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

A：S1組8周時(shí)；B：S1組12周時(shí)；C：S2組8周時(shí)；D：S2組12周時(shí)；E：S3組8周時(shí)；F：S3組12周時(shí) 圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×200)

2.3 各組小鼠肺動(dòng)脈組織TGF-β1的表達(dá)水平比較 S1組8周及12周時(shí)肺動(dòng)脈無 TGF-β1 陽性染色，S2組8周及12周時(shí)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿 TGF-β1強(qiáng)陽性染色。S3組8周及12周時(shí)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿 TGF-β1強(qiáng)陽性染色。見圖2。S2組8周、12周時(shí)，TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量均較同期S1組顯著增加(P<0.05)，且12周時(shí)明顯高于8周亞組(P<0.05)。S3組8周及12周時(shí)TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)亦明顯高于同期S1組(P<0.05)，但與同期S2組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.4 肺組織IL-17、Smad3表達(dá)水平比較 S2組肺組織IL-17、Smad3表達(dá)水平隨煙霧暴露時(shí)間延長而增加，且較同期S1組增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S3組8周及12周時(shí)，肺組織IL-17、Smad3表達(dá)較同期S2組減少，但較同期S1組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

A：S1組8周時(shí)；B：S1組12周時(shí)；C：S2組8周時(shí)；D：S2組12周時(shí)；E：S3組8周時(shí)；F：S3組12周時(shí) 圖2 免疫組化法檢測肺動(dòng)脈組織TGF-β1的表達(dá)水平(DAB 顯色，×200)

2.5 血清中 IL-17 的水平比較 S2組血清IL-17水平隨煙霧暴露時(shí)間延長表達(dá)增加，且較同期S1組增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S3組8周及12周時(shí)，血清IL-17水平高于同期S1組(P<0.05)，但低于同期S2組(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺血管重塑指標(biāo)及免疫組化檢測指標(biāo)比較

2.6 TGF-β1與WA%、WT%及肺組織IL-17、Smad3的相關(guān)性分析 肺動(dòng)脈中TGF-β1表達(dá)水平與WA%、WT%(r=0.797、0.901，P<0.01)以及肺組織IL-17、Smad3(r=0.479、0.891，P<0.01)表達(dá)水平均呈正相關(guān)。

3 討論

肺血管重塑是肺動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜和外膜共同增厚的過程。香煙煙霧可以直接作用于肺血管，在未發(fā)生缺氧、肺功能下降和肺血管床損毀的情況下，即可引起肺血管重塑，但具體機(jī)制尚不完全明確。

龍翔等[5]研究發(fā)現(xiàn)，吸煙的COPD病人及吸煙的肺功能正常人群肺組織中的IL-17信使RNA 的相對(duì)表達(dá)量及 IL-17細(xì)胞因子均較未吸煙者增高。在對(duì)低壓低氧復(fù)制缺氧性肺動(dòng)脈高壓(PAH)大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，低壓低氧后，大鼠肺組織及血清中IL-17表達(dá)水平增高，分析認(rèn)為低壓低氧后，Th17細(xì)胞在肺組織中增多，導(dǎo)致肺組織 IL-17水平增高，IL-17可以刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1等黏附分子，并能增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等生長因子的促增殖作用，共同參與肺血管重塑[3]。IL-17能募集及活化中性粒細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞活化及刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)，促進(jìn)新生血管的生成[6]。IL-17是 Th17 細(xì)胞的主要效應(yīng)因子。Th17細(xì)胞的分化需要TGF-β信號(hào)的參與。

TGF-β1具有重要的免疫調(diào)節(jié)和致纖維化活性，故而在氣道炎癥及氣道重塑中占重要地位[7]。其存在于所有的哺乳動(dòng)物中，上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞都能夠合成并釋放TGF-β1。研究表明，在炎癥反應(yīng)明顯的COPD大鼠中,其肺小動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞TGF-β1表達(dá)增高[2]。吸煙也可以導(dǎo)致大鼠氣道上皮細(xì)胞 TGF-β1表達(dá)明顯升高，而且香煙煙霧刺激時(shí)間越長，TGF-β1表達(dá)越多[8]。

本實(shí)驗(yàn)通過建立煙霧暴露大鼠肺血管重塑模型，經(jīng)HE染色觀察到煙霧暴露后各組大鼠肺血管都發(fā)生了不同程度的炎癥浸潤及管壁變形、增厚，管腔狹窄等，其中以吸煙 12周的小鼠血管的改變最為明顯。通過計(jì)算血管重塑的客觀指標(biāo)(WA%和WT%)，證實(shí)肺血管重塑隨煙霧暴露時(shí)間延長而逐漸加重，肺血管重塑程度與煙霧暴露時(shí)間呈正比。而隨煙霧暴露時(shí)間延長，大鼠肺組織及血清中IL-17表達(dá)亦增高，肺組織中Smad3表達(dá)增加，與肺動(dòng)脈組織中TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)；肺動(dòng)脈組織中TGF-β1表達(dá)增高，與肺血管重塑水平呈正相關(guān)。表明IL-17、Smad3、TGF-β1在肺血管重塑中起重要作用。在一項(xiàng)對(duì)COPD病人的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，COPD病人的血清、肺泡灌洗液中IL-17的含量均明顯增高，表明IL-17可能在COPD的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用[9]。加入Smad3抑制劑進(jìn)行干預(yù)后，肺血管組織中TGF-β1未明顯減少，但血清IL-17及肺組織中IL-17明顯減少，肺血管重塑程度較同期S2組減輕，表明在IL-17、TGF-β1參與的肺血管重塑過程中，TGF-β/Smad3通路起重要作用。

TGF-β發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)主要依賴于其下游高度保守的胞內(nèi)信號(hào)蛋白-Smads蛋白家族介導(dǎo)的信號(hào)傳遞,TGF-β通過激活其受體的Smad2和Smad3，聯(lián)合核轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。作為TGF-β1的下游信號(hào)，Smad3是參與 COPD發(fā)病的關(guān)鍵性細(xì)胞因子。野百合堿PAH模型大鼠肺動(dòng)脈中，TGF-β1、磷酸化Smad3 蛋白表達(dá)明顯升高，Smad3 磷酸化水平顯著增高，證實(shí)在PAH大鼠肺動(dòng)脈中TGF-β/Smad3信號(hào)通路呈顯著活化狀態(tài)，參與大鼠PAH的發(fā)生發(fā)展過程[10]。SB431542為特異性ALK5抑制劑，即TGF-β受體Ⅰ的抑制劑，可以抑制ALK5激活對(duì)下游信號(hào)分子Smad2/3的磷酸化，從而阻斷依賴Smad 途徑。本次實(shí)驗(yàn)表明，使用SB431542能減少IL-17表達(dá)，減輕肺血管重塑程度。但肺血管重塑發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能有多種信號(hào)通路參與其中，Smad信號(hào)通路是其中途徑之一。在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中，TGF-β1 還可能誘導(dǎo)非Smad信號(hào)通路。

綜上所述，煙霧暴露大鼠肺組織中IL-17、肺血管組織中TGF-β1表達(dá)明顯增高，通過多種途徑參與肺血管重塑過程，其中Smad3在促進(jìn)IL-17表達(dá)及肺血管重塑中起重要作用，SB431542通過阻斷TGF-β/Smad通路可能減輕肺血管重塑程度，可能為今后COPD、肺血管疾病的治療提供方向。但本研究未對(duì)SB431542的使用劑量進(jìn)一步探討，使用抑制劑的不良反應(yīng)需長期觀察。而且IL-17參與肺血管重塑可能存在多種途徑，仍需進(jìn)一步研究。