劉東東，周李芳，楊華暉

荊州市中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，湖北 荊州 448002

喉癌是臨床常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，其中，絕大多數(shù)為喉鱗狀細(xì)胞癌，主要表現(xiàn)為呼吸困難、發(fā)音困難、聲音嘶啞等臨床癥狀，其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，可能與飲酒、吸煙、咽喉反流、胃食管反流、微量元素缺乏和放射線(xiàn)等因素有關(guān)，且通常多種因素相互作用[1-2]。根據(jù)發(fā)生位置的不同，喉癌可分為聲門(mén)上型、聲門(mén)型和聲門(mén)下型，具有局部腫瘤浸潤(rùn)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處擴(kuò)散等特征。接頭蛋白CrkⅡ?yàn)樵┗駽rk表達(dá)的產(chǎn)物，在蛋白質(zhì)之間起介導(dǎo)作用，介導(dǎo)細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3-4]。CrkⅡ與細(xì)胞骨架重構(gòu)、侵襲、增殖、遷移及凋亡等均有一定關(guān)系[5]。本研究分析CrkⅡ表達(dá)對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2增殖、遷移及侵襲的影響，為喉癌患者的臨床診療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年12月至2018年12月荊州市中醫(yī)醫(yī)院收治的喉癌患者，所有患者均經(jīng)病理檢查確診為喉鱗狀細(xì)胞癌，年齡為38～74歲，平均（56.27±5.09）歲。本研究共納入108例喉癌患者，收集其喉癌組織及癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣＞0.5 cm）的石蠟存檔標(biāo)本。喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2由本院頭頸腫瘤課題組提供。

1.2 主要試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，Opti-MEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，pGPU6/RFP/Neo載體購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。倒置熒光顯微鏡、水浴鍋均購(gòu)自德國(guó)Leica公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司，數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自常州金南儀器制造有限公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化染色方法及結(jié)果判定 采用免疫組化染色法檢測(cè)喉癌組織中CrkⅡ蛋白的表達(dá)情況，CrkⅡ蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，少許表達(dá)于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞[6]。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，對(duì)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量和腫瘤細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)算。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色計(jì)0分，淺棕色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，深棕色計(jì)3分。染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分相加，≤3分為陰性表達(dá)，＞3分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2 CrkⅡRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建與驗(yàn)證 通過(guò)NCBI檢索CrkⅡ基因序列，設(shè)計(jì)干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）序列，基因 ID 為1398，mRNA 序列號(hào)為 NM-016823。使用 Invitrogen公司在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)靶向CrkⅡ基因的siRNA干擾序列，依據(jù)序列設(shè)計(jì)原則，經(jīng)NCBI行BLAST同源對(duì)比后，篩選出最優(yōu)siRNA序列，并設(shè)計(jì)一條無(wú)關(guān)序列作為陰性對(duì)照。針對(duì)CrkⅡ基因的shRNA序列插入至質(zhì)粒載體內(nèi)，包含目的基因的序列全部無(wú)誤，表明CrkⅡRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.3.3 載體選擇與構(gòu)建 選取pGPU6/RFP/Neo表達(dá)載體，此載體內(nèi)含有Neomycin抗性篩選標(biāo)記基因和紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）表達(dá)基因，以便篩選穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞系并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，于Bbsl和BamH1酶切位點(diǎn)插入設(shè)計(jì)好的siRNA序列，并委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成CrkⅡRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建和測(cè)序。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng) ①細(xì)胞復(fù)蘇：取出凍存的Hep-2細(xì)胞，置入預(yù)熱（39℃）水浴鍋內(nèi)，解凍后將細(xì)胞懸液吸出，置于離心管內(nèi)，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基10 ml，選取1支廢棄離心管配平，離心后加入完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞并充分吹打，預(yù)防細(xì)胞呈團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)充完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。②細(xì)胞傳代：細(xì)胞融合至80%時(shí)，倒掉舊培養(yǎng)液，立刻加入2 ml無(wú)菌PBS，沖洗2次后將1 ml 0.25%胰蛋白酶加入培養(yǎng)瓶，翻轉(zhuǎn)使細(xì)胞與胰蛋白酶充分接觸，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 min，巴氏吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫落并形成單個(gè)細(xì)胞懸液，以1∶2或1∶3的比例接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再置入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，第2天換液。③細(xì)胞凍存：將完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）按照9∶1的比例制備凍存液，融合度為70%～80%時(shí)選取細(xì)胞，于倒掉原有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中加入2 ml PBS，沖洗2次，PBS洗掉后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶，貼壁細(xì)胞完全消失后加入培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，以2500 r/min的離心速度離心6 min后，去除原培養(yǎng)液和胰蛋白酶，加入至預(yù)先配置好的凍存培養(yǎng)液，使用巴氏吸管將細(xì)胞吹散為細(xì)胞懸液，采用1 ml凍存管分裝。

1.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，補(bǔ)足2 ml無(wú)抗生素完全培養(yǎng)基，確保轉(zhuǎn)染時(shí)融合度為60%～80%，于150 ml無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM內(nèi)稀釋4.0 mg NDA，搖勻；于150 ml無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM內(nèi)稀釋10 ml LipofectamineTM2000試劑，搖勻后孵育6 min，將稀釋的LipofectamineTM2000試劑加入至質(zhì)粒稀釋液內(nèi)，室溫下孵育20 min，將上述轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入至各個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)，并上下左右翻轉(zhuǎn)使細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物充分接觸，后放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h，去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入不含抗生素的完全培養(yǎng)基。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為空白對(duì)照組（無(wú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒）和實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CrkⅡ干擾質(zhì)粒）。將CrkⅡRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Hep-2細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，使用倒置熒光鏡觀(guān)察RFP的表達(dá)情況，細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光表明CrkⅡRNA干擾質(zhì)粒能夠?qū)ep-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，且Hep-2細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)CrkⅡ。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CrkⅡmRNA表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染后提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA第一條鏈，行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，CrkⅡ的上游引物為5'-GATTGAGATGATTTTGGAG-3'，下游引物為5'-GTATGTTAAGTATATGATTG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度是482 bp；內(nèi)參β-actin的上游引物為5'-CTTGATCGTACGTAGCCTGA-3'，下游引物問(wèn)5'-GTGTAGTGTACTGTCATGCA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度是 482 bp。42℃預(yù)變性，60 min；70℃，15 min；PCR反應(yīng)條件：94 ℃，45 s；55 ℃，50 s；72 ℃，75 s，共40次循環(huán)。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)CrkⅡ蛋白表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染后提取總蛋白，組織裂解后上樣電泳，初始電壓為80 V，溴酚藍(lán)染料前緣進(jìn)入至分離膠上緣后，提高電壓至100 V，溴酚藍(lán)泳出分離膠下緣后電泳結(jié)束。采用半干電轉(zhuǎn)移儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜內(nèi)，以30 mA恒流連續(xù)處理90 min。取出PVDF膜后，采用5%TBST脫脂奶粉封閉，振蕩60min。結(jié)束封閉后采用TNS-T漂洗液洗膜3次，每次10 min，將膜轉(zhuǎn)移至雜交袋內(nèi)，加入適量漂洗液稀釋抗體，封口后于4℃下孵育過(guò)夜；用TBST漂洗液洗膜3次，每次10 min，加入漂洗液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，振蕩60 min。PVDF膜置于電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯色液內(nèi)振蕩溫育5 min，暗室下曝光、顯影和定影。清水沖洗后，晾干掃描，采用IPP軟件對(duì)掃描圖像的目的條帶行灰度分析。

1.3.8 噻唑藍(lán)法檢測(cè)Hep-2細(xì)胞增殖情況 采集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞懸液含量為1×104/ml，96孔板接種，倒入200 ml細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；然后，每孔內(nèi)加入劑量為5 mg/ml的噻唑藍(lán)（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）溶液20 ml，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h；倒掉原MTT培養(yǎng)液，加入DMSO溶解液150 ml，培養(yǎng)板置于搖床振蕩8 min，充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚。于24、48、72 h分別取一塊96板孔，測(cè)定各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.3.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 于無(wú)血清培養(yǎng)液中“饑餓”處理細(xì)胞，將細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)后稀釋至1×105/ml，接種至Transwell小室中，添加0.5 ml細(xì)胞懸液，于24孔板下室加入0.75 ml含10%FBS的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)孔內(nèi)加入1 ml 4%甲醛溶液，固定10 min，PBS洗滌，然后，每孔加入1 ml 0.1%結(jié)晶紫溶液，染色30 min，PBS洗滌3次，晾干后置于顯微鏡下觀(guān)察。

1.3.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hep-2細(xì)胞遷移能力采集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將重懸細(xì)胞濃縮至5×105/ml，6板孔內(nèi)分別加入細(xì)胞懸液2 ml，細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，采用加樣槍頭在6孔板底中劃痕，PBS沖洗，去除脫落細(xì)胞，而后加入培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用軟件測(cè)量并計(jì)算培養(yǎng)24、48 h后細(xì)胞的遷移率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CrkⅡ蛋白表達(dá)情況的比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，喉癌組織中CrkⅡ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為68.52%（74/108），明顯高于癌旁正常組織的9.26%（10/108），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.157，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征喉癌患者喉癌組織中CrkⅡ蛋白的表達(dá)情況

臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織分化程度為中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移喉癌患者喉癌組織中CrkⅡ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織分化程度為高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、性別喉癌患者喉癌組織中CrkⅡ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的108例喉癌患者喉癌組織中CrkⅡ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況

2.3 CrkⅡRNA 干擾質(zhì)粒測(cè)序及轉(zhuǎn)染情況

CrkⅡRNA干擾質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，針對(duì)CrkⅡ基因的shRNA序列插入至質(zhì)粒載體內(nèi)，包含目的基因的序列全部準(zhǔn)確無(wú)誤，CrkⅡRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。CrkⅡRNA轉(zhuǎn)染至Hep-2細(xì)胞內(nèi)72 h時(shí)，Hep-2細(xì)胞中可觀(guān)察到穩(wěn)定表達(dá)的RFP。

2.4 喉癌細(xì)胞Hep-2中CrkⅡmRNA的表達(dá)情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組喉癌細(xì)胞Hep-2中CrkⅡmRNA 的表達(dá)水平分別為（1.00±0.00）、（1.03±0.02）、（0.52±0.02），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.097，P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組喉癌細(xì)胞Hep-2中CrkⅡmRNA的相對(duì)表達(dá)量低于陰性、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.498、4.117，P＜0.05）。

2.5 喉癌細(xì)胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的表達(dá)情況

空白對(duì)照組喉癌細(xì)胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.84±0.03），陰性對(duì)照組喉癌細(xì)胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.83±0.04），實(shí)驗(yàn)組喉癌細(xì)胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.46±0.03），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.014，P=0.003）。實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)胞中CrkⅡ蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.509、5.226，P＜0.05）。

2.6 CrkⅡ蛋白表達(dá)下調(diào)對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖能力的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，3組細(xì)胞的OD值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的OD值均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染后Hep-2細(xì)胞OD值的比較（±s）

表2 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染后Hep-2細(xì)胞OD值的比較（±s）

注：*與實(shí)驗(yàn)組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組F值P值24 h 0.37±0.01*0.37±0.02*0.33±0.02 3.978 0.015 48 h 0.68±0.02*0.68±0.01*0.57±0.02 5.262 0.009 72 h 0.81±0.01*0.81±0.02*0.68±0.02 4.946 0.010

2.7 CrkⅡ蛋白表達(dá)下調(diào)對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，CrkⅡ蛋白的表達(dá)下調(diào)后，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基質(zhì)膜至下室的細(xì)胞數(shù)目為（98±6），陰性對(duì)照組穿過(guò)基質(zhì)膜至下室的細(xì)胞數(shù)目為（150±7），空白對(duì)照組穿過(guò)基質(zhì)膜至下室的細(xì)胞數(shù)目為（154±6），3組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.294，P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基質(zhì)膜至下室的細(xì)胞數(shù)目低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.509、3.921，P＜0.05）。（圖1）

圖1 Transwell 檢測(cè)不同組別Hep-2細(xì)胞的侵襲能力（SP法染色，×200）

2.8 CrkⅡ基因沉默對(duì)Hep-2細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，3組細(xì)胞的遷移率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，3組細(xì)胞的遷移率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移率低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)Hep-2細(xì)胞遷移率的比較（%，±s）

表3 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)Hep-2細(xì)胞遷移率的比較（%，±s）

注：*與實(shí)驗(yàn)組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組F值P值24 h 0.21±0.03 0.20±0.04 0.19±0.04 0.418 0.374 48 h 0.61±0.06*0.59±0.07*0.24±0.05 8.153 0.001

3 討論

本研究結(jié)果顯示，CrkⅡ蛋白在喉癌組織中高表達(dá)，在癌旁正常組織內(nèi)僅少量表達(dá)，說(shuō)明CrkⅡ蛋白可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與進(jìn)展關(guān)系密切。本研究中，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期高和組織分化程度為中低分化的喉癌患者喉癌組織中CrkⅡ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率較高，說(shuō)明CrkⅡ蛋白可促進(jìn)喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移?；虺聊傅氖巧矬w中特定基因的表達(dá)被抑制或不表達(dá)的狀況，發(fā)生于兩個(gè)水平：①轉(zhuǎn)錄后基因沉默；②位置效應(yīng)、DNA甲基化和異染色質(zhì)化等導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平內(nèi)基因不表達(dá)[7]。RNAi是序列特異性的、天然的轉(zhuǎn)錄后基因沉默路徑，廣泛存在于真核生物內(nèi)[8-10]。本研究采用RNA干擾技術(shù)將CrkⅡRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Hep-2細(xì)胞，而后采用Western blot和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)CrkⅡRNA干擾質(zhì)粒的干擾效率，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)胞中CrkⅡ在蛋白、mRNA水平上的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，說(shuō)明本研究采用CrkⅡ RNA干擾質(zhì)粒將CrkⅡ基因成功敲除，使喉癌細(xì)胞株Hep-2中CrkⅡ的表達(dá)含量降低。

本研究中，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)胞的細(xì)胞活力低于對(duì)照組，且隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)胞的細(xì)胞活力降低得更加明顯，說(shuō)明CrkⅡ表達(dá)下調(diào)抑制了Hep-2細(xì)胞的增殖能力。為了進(jìn)一步將質(zhì)粒和脂質(zhì)體細(xì)胞毒性對(duì)細(xì)胞所產(chǎn)生的影響進(jìn)行排除，本研究設(shè)立陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，結(jié)果顯示，兩個(gè)對(duì)照組細(xì)胞的增殖情況差異不明顯，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)不受質(zhì)粒與脂質(zhì)體細(xì)胞毒性的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移率低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，說(shuō)明CrkⅡ表達(dá)下調(diào)能夠抑制Hep-2細(xì)胞的遷移能力。機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞遷移過(guò)程復(fù)雜，主要依賴(lài)于細(xì)胞外基質(zhì)重塑、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間附著變化、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架協(xié)調(diào)重建和相關(guān)信號(hào)調(diào)節(jié)[11-13]。有研究顯示，整合素信號(hào)對(duì)p130Cas-Crk-Dock180復(fù)合物刺激后可將Racl激活，對(duì)形成黏著斑、偽足延伸與肌肉蛋白骨架重塑起調(diào)節(jié)作用，從而發(fā)生細(xì)胞遷移[14-15]。所以，整合素信號(hào)傳遞受影響與Hep-2細(xì)胞內(nèi)CrkⅡ表達(dá)下調(diào)后其遷移能力受限可能有關(guān)系。Transwell侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果近似，說(shuō)明CrkⅡ表達(dá)下調(diào)后，Hep-2細(xì)胞的侵襲能力也下降。研究顯示，腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲與CrkⅡ蛋白過(guò)表達(dá)有關(guān)，CrkⅡ蛋白過(guò)表達(dá)可造成腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，CrkⅡ過(guò)表達(dá)可激活下游效應(yīng)因子Rap、Rac1，加速細(xì)胞擴(kuò)散，同時(shí)CrkⅡ可通過(guò)抑制β-連環(huán)蛋白與E-鈣粘蛋白的聚集加速上皮黏附連接的分解，進(jìn)而加速乳腺癌細(xì)胞的擴(kuò)散[16]。同時(shí)，RNA干擾所介導(dǎo)的CrkⅡ基因沉默能夠使CrkⅡ表達(dá)下調(diào)后抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲與遷移。

綜上所述，喉癌細(xì)胞Hep-2中CrkⅡ的表達(dá)下調(diào)可明顯降低細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力，CrkⅡ蛋白有可能成為喉癌臨床治療中的新靶點(diǎn)。