張彥燕，何 麗，黃 梅，姜 豐，付凌云，李佳川

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041)

新近研究表明，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)可通過活化炎癥因子，促進(jìn)血小板黏附聚積等機(jī)制促進(jìn)As的發(fā)生發(fā)展，成為動脈粥樣硬化新的、獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[1-2].而氧化應(yīng)激損傷為動脈粥樣硬化的關(guān)鍵病理過程[3]，其中核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是新近發(fā)現(xiàn)的抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子[4-5].研究顯示，上調(diào)Nrf2信號可激活機(jī)體抗氧化酶與II相藥物代謝酶，提高細(xì)胞對活性氧(reactive oxygen species，ROS)的清除能力.因此，積極尋找可調(diào)控Nrf2分子信號的防治藥物具有重要意義.

紅景天苷(salidroside)是景天科(Crassulaceae)紅景天屬植物紅景天的主要有效成分，具有抗自由基損傷、抗氧化、抗疲勞、耐缺氧等藥理作用[6-7]，但其對Hcy誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制尚未明確.本研究擬基于Nrf2信號，分析紅景天苷對氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)的影響，明確其對Hcy損傷的血管內(nèi)皮的保護(hù)作用及可能機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購于美國Siencell公司；紅景天苷購自西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶、凍存液，均購自美國Sciencell公司；Hcy、MTT購于Sigma公司；乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理

選擇3～8代生長狀態(tài)良好的HUVEC，復(fù)蘇，加入5%血清的完全培養(yǎng)基后置于37℃、5%CO2的濕熱恒溫培養(yǎng)箱中，視細(xì)胞生長情況換液及傳代.以1×105個/ml的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)，隨機(jī)分為正常對照組、模型組(Hcy，1mmol/L)、紅景天苷高劑量組(SAL，50 μmol/L)、紅景天苷低劑量組 (SAL，10 μmol/L)，待細(xì)胞處于增殖期后分組實(shí)驗(yàn).各組預(yù)先給予SAL孵育2 h后，再加入Hcy(1 mmol/L)共孵育12h復(fù)制氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型.

1.3 細(xì)胞存活率檢測

將細(xì)胞接種于96孔板中，采用MTT法測定細(xì)胞存活率.

1.4 LDH、MDA、SOD 活性檢測

將細(xì)胞接種于24孔板中，經(jīng)培養(yǎng)及分組處理后收集各組培養(yǎng)細(xì)胞上清液，乳酸脫氫酶檢測試劑盒測定上清液中LDH活性.胰酶消化法收集各組細(xì)胞，PBS離心洗滌3次，以超聲法破碎細(xì)胞，離心收集上清液待測.待測樣品按照MDA、SOD試劑盒所述方法分別測定其細(xì)胞內(nèi)含量.

1.5 細(xì)胞活性氧簇(ROS)檢測

將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)70% ～80%時(shí)，按1.2項(xiàng)下方法分組處理.經(jīng)PBS洗滌后于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入10μΜ的DCFH-DA，置于培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min，用無血清ECM清洗3～4次.采用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)各組熒光照片中陽性細(xì)胞面積和平均光密度(IDO)值.

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA表達(dá)

Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，取2μgA260-A280為1.8～2.0的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.以GAPDH為內(nèi)參，按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒所述方法檢測cDNA產(chǎn)物中Nrf2、HO-1、NQO1的豐度.引物序列如下，Nrf2上游引物:5’-TCCTATGCGTGAATC-CCAAT-3’，Nrf2下游引物:5’-GCGGCTTGAATGTTTGTCTT-3’；HO-1上游引物:5’ -GGGCTGTGAACTCTGTCCAAT-3’，下游引物:5’ -GGTGAGGGAACTGTGTCAGG-3’；NQO1上游引物:5’ -TTCTGTGGCTTCCAGGTCTT-3’，下游引物:5’ -TCCAGACGTTTCTTCCATCC-3’.設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)處理30 s，后進(jìn)行40次循環(huán)，循環(huán)條件為95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s.目的基因的相對表達(dá)量按照公式2-△△Ct計(jì)算.

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x-±s)表示，SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.采用Student t檢驗(yàn)(T-test)，P＜0.05表示具有差異，P＜0.01表示具有顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 SAL對細(xì)胞存活率的影響

正常對照組、模型組、紅景天苷高、低劑量組(50，10 μmol/L)細(xì)胞存活率分別為 100%、72.74%、97.24%、88.71%.Hcy作用后細(xì)胞存活率顯著降低(P＜0.01)，預(yù)先給予SAL孵育后，SAL高、低劑量組細(xì)胞存活率明顯提高(P＜0.01，P＜0.05).

2.2 SAL對上清液LDH及細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD活性的影響

經(jīng)Hcy誘導(dǎo)孵育后，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH釋放量和細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯升高(P＜0.01)，SOD水平明顯降低(P＜0.01)，表明HUVEC細(xì)胞氧化與抗氧化水平失衡.紅景天苷預(yù)給藥后，高、低劑量SAL可明顯降低LDH釋放量(P＜0.01)，降低MDA水平(P＜0.01，P＜0.05)，明顯提高 SOD 活性(P＜0.01，P＜0.05)，結(jié)果見表1.

表1 SAL對LDH、MDA、SOD活性的影響(±s，n ＝6)Table 1 Effects of SAL on LDH，MDA and SOD activity(±s，n ＝6)

表1 SAL對LDH、MDA、SOD活性的影響(±s，n ＝6)Table 1 Effects of SAL on LDH，MDA and SOD activity(±s，n ＝6)

注:與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較，與△P ＜0.05，△△P ＜0.01(下同)

組別 LDH(U/L)MDA(μmol/g)SOD(U/mg)正常對照組 178.24±6.82 2.48±0.34 37.21±1.8模型組 284.36±9.45** 8.41±0.52** 16.54±2.17**SAL高劑量組 227.61±7.13△ 4.07±0.36△△ 32.49±2.33△△SAL低劑量組 243.76±6.57△ 5.26±0.42△ 26.64±2.59△

2.3 SAL對ROS的影響

正常對照組、模型組、SAL高、低劑量組IDO值分別為85.41±14.62、367.04±18.33、123.76±19.28、254.46±24.76.結(jié)果表明，Hcy顯著升高內(nèi)皮細(xì)胞IDO值(P＜0.01)，SAL高低劑量干預(yù)給藥可明顯降低細(xì)胞ROS水平，組間比較P＜0.01.SAL對各組ROS的影響情況見圖1.

圖1 SAL對ROS的影響Fig.1 Effect of SAL on ROS

2.4 SAL對Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)的影響

采用qRT-PCR分析各組細(xì)胞抗氧化信號Nrf2、NQO1與HO-1的mRNA表達(dá)水平.結(jié)果表明，SAL高低劑量預(yù)給藥后可明顯上調(diào)Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2、NQO1與HO-1的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果見表2.

表2 SAL對Nrf2、HO-1及NQO1 mRNA表達(dá)的影響(x±S，n＝3)Table 1 Effects of SAL on the mRNA expression of Nrf2，HO-1 and NQO1(x ± s，n ＝3)

3 討論

近年發(fā)現(xiàn)，許多冠心病患者并不存在傳統(tǒng)的As致病因素(如高脂血癥、高血壓等)，但其中高同型半胱氨酸血癥占一定比例，Hcy已成為AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8].Hcy可通過影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，介導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展[9].本研究通過建立Hcy誘導(dǎo)HUVECs氧化應(yīng)激損傷模型，明確紅景天苷預(yù)給藥后對細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，并基于Nrf2信號對其抗氧化作用機(jī)制進(jìn)行了分析.

在危險(xiǎn)因素的刺激下，細(xì)胞通過自身氧化產(chǎn)生大量的活性氧和活性氮，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)的聚積，引發(fā)機(jī)體氧化/抗氧化穩(wěn)態(tài)的失衡，為動脈粥樣硬化的關(guān)鍵病理過程[10].MDA是氧自由基過氧化反應(yīng)的毒性終產(chǎn)物，其水平可反映機(jī)體氧自由基的清除能力.SOD為機(jī)體重要的抗氧化劑，可減輕氧自由基對細(xì)胞的過氧化損傷[11].本研究通過MTT法、LDH活性實(shí)驗(yàn)表明，1 mmol/L Hcy誘導(dǎo)12h顯著引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而SAL高、低劑量預(yù)給藥后，明顯提高細(xì)胞存活率，降低LDH活性.同時(shí)，SAL能夠抑制Hcy誘導(dǎo)的ROS的增加，降低細(xì)胞內(nèi)MDA水平，提高SOD的活性，表明SAL對Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用.

Nrf2/ARE是體內(nèi)協(xié)調(diào)抗氧化應(yīng)激的重要信號通路，其通過促進(jìn)系列抗氧化基因的表達(dá)，提高細(xì)胞的抗氧化能力[12].當(dāng)ROS、親電子物質(zhì)或其他有害物質(zhì)引起氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2可與 Keap1解偶聯(lián)，游離的Nrf2可與自身啟動子近側(cè)區(qū)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，激活抗氧化酶基因 HO-1、醌氧化還原酶NQO1等相關(guān)基因的表達(dá)，維持氧化/抗氧化的平衡穩(wěn)態(tài)[13-17].本研究采用RT-PCR技術(shù)分析了抗氧化基因的表達(dá)量，與模型組相比，SAL能夠上調(diào)抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的基因表達(dá)，并增加Nrf2信號下游HO-1、NQO1信號的mRNA的表達(dá).結(jié)果表明，紅景天苷可通過上調(diào)Nrf2信號的表達(dá)，同時(shí)增加下游抗氧化基因的表達(dá)，提示SAL可通過改善氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮其心血管藥理學(xué)活性.