陳加蓓，李 貴，3，魏 華，陳功錫

(1.吉首大學植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首 416000；2.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南吉首 416000；3.中南大學生命科學學院，湖南長沙 410078)

鼠麴草(Gnaphalium affineD.Don)是菊科Compositae鼠麴草屬Gnaphalium一年生草本植物.作為我國傳統(tǒng)中草藥及湘西民族傳統(tǒng)特色食品“蒿菜粑粑”原料植物，鼠麴草廣泛分布于我國臺灣、華東、華南、華中、華北、西北及西南各省區(qū)，其莖葉為鎮(zhèn)咳、祛痰、治氣喘和支氣管炎以及非傳染性潰瘍、創(chuàng)傷之常用藥，內服還有降血壓等療效[1-3].鼠麴草還具有抗組胺、抗細菌和真菌、抗氧化、抗心衰、平喘、抗黃嘌呤氧化酶、光防護、抗補體和保肝等生物活性[4].研究表明鼠麴草具活性的主要化學成分有黃酮類、苷類、氨基酸、三萜類、植物甾醇和咖啡酸衍生物等[4-5].本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該植物的醇提取部位，主要含有黃酮類化合物.鼠麴草中的黃酮類成分為其抗炎、抗氧化作用主要活性成分之一[6-8].黃酮類成分的提取主要有微波提取法、超聲波提取法、回流提取法等方法.微波提取法具有提取速度快，提取效率高等特點；微波提取的響應面法具有實驗次數(shù)少，時效性好、統(tǒng)計分析全面、選擇性廣、預測精度較高等優(yōu)點；K-B紙片抑菌法具有重復性較好、操作簡便、試驗成本相對較低、結果直觀等優(yōu)點[9].湘西地區(qū)處于生物多樣性及其豐富的武陵山區(qū)，“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草資源豐富，鼠麴草黃酮類等有效成分的資源和分布等并不清楚.因此，這一具有民族特色的地區(qū)“蒿菜粑粑”原料植物具有極大的經(jīng)濟社會價值和應用前景.本研究主要以“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草為材料，擬通過單因素實驗及響應面法優(yōu)化其總黃酮的微波提取工藝，并通過K-B紙片法對其抑菌活性展開研究，為具經(jīng)濟社會價值的湘西“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草的綜合開發(fā)和循環(huán)應用提供科研基礎.

1 材料

1.1 儀器設備

EXCEL-2010微波化學工作平臺(上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司)；LE204E/02電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；BSC-04IIB2生物安全柜(蘇凈集團安泰公司)；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；UV-2600紫外可見分光光度計[島津儀器(蘇州)有限公司]；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-2000A型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SPX-250Bш型生化培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；MLS-3780型高壓蒸汽滅菌器(SANYO公司)等.

1.2 材料與試劑

“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草地上部分，于2019年4月采自湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市，憑證標本材料存于吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院植物標本館.將所采新鮮鼠麴草洗凈晾干后于50℃恒溫干燥，粉碎，過30目篩，裝袋備用.

蘆丁對照品:中國食品藥品檢定研究院，批號:10080-201811；無水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯化鈉、葡萄糖、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純試劑；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂，為生化試劑；實驗用水為去離子水.

6種抑菌指示菌分別為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisATCC 6051)、大腸埃希菌(Escherichia coliATCC 128)、變形桿菌(Proteus vulgarisATCC 8427)、藤黃八疊球菌(Sarcina luteaCGMCC 1.880)、白色念珠菌(Canidia albicansNCPC 1027)和黑曲霉(Aspergillus nigerNCPC 1003)均由吉首大學微生物資源與生態(tài)實驗室提供.

2 方法

2.1 總黃酮標準曲線的制備

準確稱取20.30 mg蘆丁標準品，置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解定容，制成濃度為186.62 mg/L的蘆丁標準使用溶液.參照文獻方法[10-11]稍作調整，取7支試管依次加入蘆丁標準使用溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，制備總黃酮標準曲線，以蘆丁標準液濃度C為撗坐標，吸光度A為縱坐標，得回歸曲線方程為吸光度A ＝0.0166C-0.0231，r2＝ 0.9987，表明在0.00～80.94 mg/L范圍內，總黃酮的質量濃度與A值呈良好的線性關系.

2.2 鼠麴草總黃酮供試品溶液的制備

鼠麴草總黃酮的提取:精密稱取0.2000 g樣品于微波提取罐中，加入一定濃度乙醇溶液，置微波工作平臺中，進行微波輔助提取，趁熱過濾，用70%乙醇定容至25 mL，搖勻，即制得鼠麴草總黃酮提取供試品溶液.

2.3 鼠麴草供試品溶液中總黃酮的測定

總黃酮得率的計算:

吸取2.2項制備的鼠麴草總黃酮供試品溶液1.0 mL置于50 mL容量瓶中，加水補充至10 mL，后續(xù)方法與“2.1”項步驟相同.在506 nm波長處測定供試品溶液的吸光度A值，通過蘆丁標準回歸方程，計算供試品溶液中總黃酮的濃度C與樣品中總黃酮得率W.

式中:W—供試樣品中總黃酮的得率(%)，C—供試品溶液中總黃酮的濃度(mg/L)，n—稀釋倍數(shù)，V—供試品溶液定容體積(mL)，m—樣品質量(g).

2.4 單因素實驗

微波提取:取鼠麴草樣品粉末0.2000 g，固定其他條件，分別考察單因素液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，mL∶g)、乙醇濃度(10%、30%、50%、70%、90%)、微波提取時間(4 min、6 min、8 min、10 min、12 min)、微波提取溫度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)對總黃酮得率的影響.

2.5 響應面實驗

在單因素實驗結果基礎上，采用響應面法對鼠麴草總黃酮提取工藝進一步優(yōu)化，以液料比、乙醇濃度、微波提取時間為自變量，按照Box-Behnken中心組合設計響應面優(yōu)化方案，選取3因素3水平的組合(表1).

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2.6 抑菌實驗

2.6.1 鼠麴草抑菌供試品溶液的制備

鼠麴草乙醇提取液的制備:稱取鼠麴草材料粉末15.0 g，加入濃度95%乙醇150 mL，65℃、250 W 超聲提取30 min后，靜置過夜、過濾.濾渣同等條件超聲重提2次，再過濾.合并濾液，濃縮至無醇味，且均配成1.5 mL溶液.

鼠麴草提取物分極性部位萃取液的制備:稱取75.0 g鼠麴草材料粉末，加入500 mL濃度為70%的乙醇，在55℃、250 W超聲條件下，提取30 min后，靜置過夜、過濾.濾渣同等條件超聲重提2次，再過濾.濾液合并，濃縮至無醇味，配成75 mL溶液，且均分成5等份，分別用等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取2次，合并2次萃取液，再分別將萃取液濃縮至1.5 mL溶液.水部位依次用等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，加入等體積的水，再將其濃縮至1.5 mL.

2.6.2 培養(yǎng)基制備

細菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基[12]，所有培養(yǎng)基均采用121℃高壓滅菌20 min后備用.其余抑菌實驗相關操作均在吉首大學微生物資源與生態(tài)實驗室進行.

2.6.3 菌種活化

以劃線法分別將供試細菌枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、變形桿菌、藤黃八疊球菌從試管斜面轉接到牛肉膏蛋白胨斜面固體培養(yǎng)基上.37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，連代培養(yǎng)2次，使菌體達到最佳生長狀態(tài)，備用.將供試的黑曲霉及白色念珠菌從試管斜面以劃線法轉接到PDA斜面固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，連代培養(yǎng)2次，使菌體達到最佳生長狀態(tài)，備用.

2.6.4 帶菌平板的制備

用接種環(huán)挑取少量的試驗菌種，接入到裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，震蕩搖勻，使菌種分布均勻，進行倒平板，備用.

2.6.5 基于藥敏濾紙片法的抑菌實驗

根據(jù)K-B紙片抑菌法，將已滅菌好的直徑為6 mm的濾紙片按1層貼于各帶菌平板上，將供試品乙醇提取液、各部位萃取液用移液槍分別移取10 μL提取液于1層紙片，置于一個帶菌平板，保持間隔并做好標記，細菌于37℃培養(yǎng)1～3天、真菌于28℃培養(yǎng)3～5天后觀察和測定抑菌圈直徑.每組抑菌實驗3個平行.以無菌水與提取液及萃取液作為對照.

2.7 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010對實驗數(shù)據(jù)進行初步分析、整理、制表與制圖，采用響應面分析軟件Design Expert.10.0對實驗的結果進行分析，并繪制響應面圖.

3 結果與分析

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 液料比對鼠麴草總黃酮得率的影響

在乙醇體積分數(shù)70%、微波時間6 min、微波溫度50℃條件下，比較不同液料比對鼠麴草總黃酮得率的影響如圖1所示:

圖1 液料比對鼠麴草總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of liquid to material ratio on total flavonoids yield from Gnaphalium affine

由圖1可知，在考察范圍內，鼠麴草總黃酮得率隨著液料比的增大呈倒S型緩慢增加.具體而言，液料比為30∶1較20∶1快速增長，液料比40∶1整體持平，50∶1略低，液料比60∶1升高.綜合考慮乙醇使用量及回收成本，初步確定液料比30∶1較合適.

3.1.2 乙醇濃度對鼠麴草總黃酮得率的影響

在液料比30∶1、微波時間6 min、微波溫度50℃條件下，比較不同乙醇濃度對鼠麴草總黃酮得率，其影響情況如圖2所示:

由圖2可知，乙醇濃度50%時鼠麴草總黃酮得率最大，乙醇濃度＞50%或者＜50%時，鼠麴草總黃酮得率均出現(xiàn)明顯下降.根據(jù)相似相溶理論，此乙醇濃度極性可能和鼠麴草黃酮化合物相近，故溶出效果較好.

3.1.3 提取時間對鼠麴草總黃酮得率的影響

在乙醇濃度70%、液料比30∶1、微波溫度50℃條件下，考察不同提取時間鼠麴草總黃酮得率的影響，結果如圖3所示:

由圖3可知，隨著提取時間的增長，鼠麴草總黃酮得率先增大，當提取時間＞8 min時，鼠麴草總黃酮得率下降，說明提取時間過短提取不充分，提取時間過長總黃酮成分被破壞，使顯色結果降低，故8 min應為較適合的提取時間.

圖2乙醇濃度對鼠麴草總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield from Gnaphalium affine

圖3 提取時間對鼠麴草總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on total flavonoids yield from Gnaphalium affine

3.1.4 提取溫度對鼠麴草總黃酮得率的影響

在乙醇濃度70%、液料比30:1、微波時間6 min的條件下，比較不同提取溫度對鼠麴草總黃酮得率的影響，其結果如圖4所示.

圖4 提取溫度對鼠麴草總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on total flavonoids yield from Gnaphalium affine

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，鼠麴草總黃酮得率逐漸增大，50℃以后，提取得率變化不明顯且趨緩.基于節(jié)能環(huán)保等方面綜合考慮，故50℃應為鼠麴草總黃酮較合適的提取溫度條件.

3.2 響應面結果

3.2.1 響應面實驗結果

由表2可知，一次項A、C和2次項B2、C2有極強的顯著性.2次項為顯著項.可見2次項B2、C2與響應值有很大的聯(lián)系，2次項A2與響應值有一定聯(lián)系，不僅是簡單的線性關系.一次項B和交互項AC、AB、BC為不顯著項.同時，通過F值可判斷單因素中影響得率主次順序為:A(液料比)＞C(提取時間)＞B(乙醇濃度).失擬誤差P＝0.3346＞0.05，差異不顯著.模型的決定系數(shù)R2為0.9430，表明該模型擬合程度好，誤差較小，可以用來分析和預測不同提取工藝條件下鼠麴草總黃酮得率的最佳理論值.由表3方差分析可知，該實驗數(shù)據(jù)所建立的模型的F值為12.88，P＝0.0014＜0.05，該模型具有顯差異著，其擬合出的回歸方程為:Y＝3.056+0.0975A-0.015B+0.075C-0.0475AB-0.0125AC-0.0375BC+0.06575A2+0.12075B2+0.14075C2

方程式中A、B、C分別為液料比、乙醇濃度、提取時間.

表2 鼠麴草總黃酮提取響應面實驗方案及結果Table 2 Experimental scheme and results of total flavonoids from Gnaphalium affine extraction for response surface

表3 響應面ANOVA分析結果Table 3 ANOVA analysis results of response surface

3.2.2 響應面交互作用分析結果

通過對三維響應面圖分析可知(如圖5所示)，液料比與乙醇濃度、液料比與提取時間、乙醇濃度與提取時間交互作用對應的等高線橢圓度較小，說明液料比、乙醇濃度、提取時間之間的交互作用相對較弱.

3.2.3 鼠麴草中黃酮提取的最佳條件驗證性實驗

經(jīng)響應面優(yōu)化，鼠麴草中總黃酮最佳提取工藝為:液料比(v/m)7∶1，乙醇濃度40%，提取時間9min.根據(jù)所擬合的最佳條件進行驗證實驗，重復3次，取平均值，結果為3.62%，與預測值3.643%相差0.63%，表明該條件可信，模型準確，重現(xiàn)性良好.

圖5 鼠麴草總黃酮提取工藝優(yōu)化響應面3D圖Fig.5 Optimized response surface 3D map of extraction process of total flavonoids from Gnaphalium affine

3.3 抑菌實驗

3.3.1 鼠麴草乙醇提取液抑菌活性

由表4可知，總體來看，“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草乙醇提取液對藤黃八疊球菌、大腸埃希菌、變形桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌均具有較好抑菌效果，空白對照組水與95%乙醇對所有菌種均無抑菌效果.根據(jù)藥敏試驗標準[13]判定鼠麴草乙醇提取液對藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌具有高敏抑菌效果，對大腸埃希菌、變形桿菌、白色念珠菌的抑菌效果為中敏，對黑曲霉具較低敏的抑菌活性.

表4 鼠麴草乙醇提取液抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of ethanol extract from Gnaphalium affine

3.3.2 鼠麴草各極性部位萃取液抑菌活性

總體來看“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草各極性部位萃取液對藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌等6種實驗用菌均有較好抑菌效果，無菌水與各萃取劑均無抑菌效果.分部位看，抑菌部位主要集中在正丁醇部位、二氯甲烷部位與乙酸乙酯部位，石油醚部位與水部位無抑菌效果，正丁醇部位與二氯甲烷部位對藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均有抑菌效果，乙酸乙酯部位只對藤黃八疊球菌、白色念珠菌有抑菌效果，以正丁醇部位抑菌種類最多，相對效果最佳.通過特征性顯色反應發(fā)現(xiàn)正丁醇部位總黃酮含量最高.根據(jù)藥敏試驗判定標準[13]，正丁醇部位與二氯甲烷部位對藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌僅僅具有低敏抑菌活性，乙酸乙酯部位對藤黃八疊球菌、白色念珠菌也僅為低敏抑菌活性(表5).

表5 鼠麴草各極性部位萃取液抑菌活性Table 5 Antibacterial activity of extracts of various polar parts from Gnaphalium affine

4 討論與結論

本研究通過單因素和響應面實驗對鼠麴草總黃酮的提取工藝進行系統(tǒng)研究，確定了總黃酮的微波提取最佳工藝條件為液料比7∶1，乙醇濃度40%，提取時間9 min.驗證實驗總黃酮得率為3.62%，與模型預測結果相符，表明響應面法是一種綜合試驗設計和數(shù)學建模的優(yōu)化方法，具有良好的預測性，能有效指導工藝參數(shù)的優(yōu)化.石青浩等[14]對鼠曲草黃酮提取單因素條件進行了初步研究，而側重在鼠麴草總酮的抗氧化活性方面的研究；本研究則在單因素水平上，進一步運用響應面法對其各因素進行了組合考察，同時在功效研究方面考察了其抑菌活性.

鼠麴草對藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌等6種試驗用菌均有較好的抑制效果，體現(xiàn)出具有一定的廣譜抑菌活性.其抑菌部位主要集中在正丁醇部位、二氯甲烷部位與乙酸乙酯部位，不同極性部位表現(xiàn)出來的不同抑菌活性，暗示不同極性部位活性成分也不盡相同.這為鼠麴草總黃酮等功能性成分的開發(fā)提供了重要的參考依據(jù)，也為湘西“蒿菜粑粑”與其原料植物的深入擴展研究和應用奠定重要基礎.