★ 王丹 劉欽玲 鄭明明 鄒國明（1.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006；.江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004；3.江西中醫(yī)藥大學歧黃國醫(yī)書院 南昌 330004）

銀屑病是一種臨床常見的以皮膚紅斑、丘疹上覆多層銀白色鱗屑為特征的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病與易感基因遺傳及自身T細胞免疫密切相關，病理表現(xiàn)為角質(zhì)細胞的角化過度、角化不全及乳頭部毛細血管擴張和真皮炎性細胞的浸潤，在臨床上主要分為四型，而尋常型銀屑?。╬soriasis vulgaris，PV）占99%以上［1］。近年來本病的發(fā)病率逐年上升，已由1984年的0.123%，上升至2017年的0.5%［2-3］。目前全國約有650萬銀屑病患者，而其中的87.6%～93.4%反復發(fā)作。銀屑病病程長，反復發(fā)作的皮疹影響患者的外貌美觀，損害患者身心健康，降低生活質(zhì)量，目前人類對本病尚未發(fā)現(xiàn)特效及根治的藥物和方法。為此大批國內(nèi)外學者投入了本病的研究，但至今仍未完全清楚其發(fā)病機理?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實Th17細胞在銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮著關鍵性作用，并成為了新的治療靶點［4-5］。諸多研究表明，miRNA對Th17細胞的作用可能是通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)其相關因子的表達與分泌，影響其分化與功能，進而引起銀屑病等諸多自身免疫性疾病的發(fā)生，而其中miR-155是促使Th17細胞發(fā)揮效應的一個重要調(diào)節(jié)因子。本課題組［6］前期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155在PV患者皮損及外周血清PBMCs以及CD4+T淋巴細胞中均有特異性表達，且在CD4+T淋巴細胞中上調(diào)最高，而SOCS1是miRNA-155重要的靶基因，miRNA-155可以直接作用于靶基因SOCS1，影響JAK/STAT信號傳導通路中STAT3的表達，從而調(diào)控Th17細胞的分化與功能及其炎性細胞因子的分泌，進而參與銀屑病發(fā)病的免疫機制。所以筆者選擇從miRNA155-SOCS1軸調(diào)控Th17細胞及相關因子角度進一步探索PV的發(fā)病機制，通過檢測PV患者皮損中及內(nèi)服竹黃顆粒前后外周血PMBC中miR-155、SOCS1、RORγt、IL-17mRNA和Th17細胞及相關因子水平， 觀察竹黃顆粒治療PV的臨床療效及對其的干預作用，探討miRNA155-SOCS1軸調(diào)控Th17細胞因子參與PV的發(fā)病機制，探索中醫(yī)藥治療PV的作用新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月—2019年12月江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院皮膚科門診及住院PV患者40例為觀察對象，其中男23例、女17例，年齡18～60歲，平均（37.25±10.76）歲，病程1個月～20年。同時對照組選擇體檢健康人群15例，其中女6例、男9例，年齡18～60歲，平均（38.26±11.45）歲。兩組年齡、性別具有可比性。

1.2 診斷標準 （1）西醫(yī)診斷參照《中國臨床皮膚病學》第二版［1］中PV的診斷標準；（2）中醫(yī)診斷依照《中醫(yī)病證診斷療效標準》［7］中白疕（血熱證）的診斷標準。

1.3 納入標準 （1）符合中醫(yī)白疕（血熱證）診斷標準和西醫(yī)PV診斷標準；（2）年齡范圍18～60歲；（3）4周內(nèi)無光療及系統(tǒng)用藥史（包括免疫抑制劑、激素類、維甲酸類），2周內(nèi)無外用制劑使用史。（4）無心肝肺腎血液等系統(tǒng)性疾病及其他皮膚病。（5）簽署知情同意書。

1.4 排除標準 妊娠、哺乳期婦女及藥物過敏者。

1.5 治療方法 觀察組：口服竹黃顆粒。竹黃顆粒由江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院顆粒劑藥房提供，主要藥物有竹葉、黃連、梔子、黃柏、水牛角、石膏、漏蘆、麥冬、黨參、山藥、三七等。每次1包，每天3次，開水沖服。4周為一療程，連續(xù)治療2個療程。觀察期間停止其他治療方法。對照組：不給予任何藥物和治療。

1.6 觀察指標 （1）用ELISA法檢測血清中IL-17、IL-6、IL-23的含量。分別采集對照組及觀察組治療前后空腹外周血5 mL，2 000 r/min，離心5 min，收集上層血清標本檢驗，操作嚴格按照ELISA試劑盒 （美國R&D公司） 要求進行。（2）實時熒光定量RT-PCR檢測觀察組治療前后及健康對照組外周血PMBC及皮膚組織中miR-155、SOCS1、RORγt及IL-17的mRNA表達水平，流式細胞儀檢測外周血PBMC中Th17細胞比例，其中5例重度PV患者，與其簽署知情同意書后，分別于皮損區(qū)及皮損周圍組織切取直徑約3 mm皮膚標本，5例正常皮膚組織標本均來自我院普外科。

1.7 療效評定標準 以PASI積分為療效評判標準。痊愈：PASI評分下降≥90%；顯效：90%＞PASI評分下降≥60%；有效：60%＞PASI評分下降≥20%；無效：PASI評分下降＜20%。總有效率=（痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)）/總病例數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用SPSS l7.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均以（）表示，設P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。外周血中各指標比較采取獨立樣本T檢驗；用單因素方差分析皮膚組織中各指標表達水平比較，組間比較用LSD法；線性相關分析檢測各指標之間的相關性。

2 結(jié)果

2.1 兩組IL-17、IL-6和IL-23含量比較 見表1。PV患者血漿中IL-17、IL-6和IL-23含量明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 兩組miR-155、SOCS1、RORγt及IL-17mRNA基因表達水平比較 見表2。PV患者皮損區(qū)、皮損周圍組織與健康正常皮膚組織miR-155、SOCS1、RORγt及IL-17mRNA基因表達水平比較，存在顯著差異（P＜0.01）。

2.3 兩組外周血PBMC中相關因子基因表達水平及Th17細胞比例比較 見表3。PV患者外周血PBMC中miR-155、RORγt、IL-17mRNA的 基 因表達水平及Th17細胞比例較健康對照者顯著升高（P＜0.01），而SOCS1顯著降低（P＜0.01）。

表1 兩組Th17細胞及相關因子表達水平比較（） pg/mL

表1 兩組Th17細胞及相關因子表達水平比較（） pg/mL

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表2 兩組miR-155、SOCS1、RORγt及IL-17mRNA基因表達水平比較（）

表2 兩組miR-155、SOCS1、RORγt及IL-17mRNA基因表達水平比較（）

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表3 兩組外周血PBMC中相關因子基因表達水平及Th17細胞比例比較（）

表3 兩組外周血PBMC中相關因子基因表達水平及Th17細胞比例比較（）

組別 n miR-155 SOCS1 RORγt IL-17 Th17細胞比例觀察組 40 5.71±1.30 0.15±0.05 6.50±1.63 7.77±1.61 3.81±1.32對照組 15 1.78±0.43 0.84±0.24 1.39±0.40 1.53±0.40 1.15±0.72 t-11.418 -10.666 -11.942 -14.760 -7.375 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.4 治療前后血漿IL-17、IL-6、IL-23表達水平比較 見表4。竹黃顆粒治療后患者血漿IL-6、IL-23含量無明顯下降（P＞0.05），IL-17含量顯著下調(diào)，與治療前比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表4 治療前后血漿IL-17、IL-6、IL-23表達水平比較（，n=40） pg/mL

表4 治療前后血漿IL-17、IL-6、IL-23表達水平比較（，n=40） pg/mL

時間 IL-17 IL-6 IL-23治療前 625.38±166.28 3944.87±515.60 240.01±102.38治療后 254.10±61.32 3737.94±499.18 200.42±89.94 t-13.208 -1.842 -1.837 P＜0.01 0.072 0.070

2.5 治療前后外周血PBMC中相關因子基因表達水平及Th17細胞比例比較 見表5。竹黃顆粒治療后患者外周血PBMC中miR-155、IL-17mRNA的基因表達水平及Th17細胞比例較治療前顯著下降，而SOCS1上升（P＜0.01），RORγt無顯著變化（P＞0.05）。

2.6 治療前、治療第4周、第8周PASI積分比較 見表6。觀察組分別在竹黃顆粒治療前、治療第4周、第8周對患者病情嚴重程度進行評分，再依據(jù)PASI評分變化來判定療效，其中痊愈10例， 顯效25例，有效5例，總有效率為87.5%。治療后PASI評分較治療前顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義，表明竹黃顆粒治療尋常型銀屑病療效確切。

表5 治療前后外周血PBMC中相關因子基因表達水平及Th17細胞比例比較（，n=40）

表5 治療前后外周血PBMC中相關因子基因表達水平及Th17細胞比例比較（，n=40）

時間 miR-155 SOCS1 RORγt IL-17 Th17細胞比例治療前 5.71±1.30 0.15±0.05 6.5±1.63 7.77±1.61 3.81±1.32治療后 1.22±0.48 0.48±0.25 5.83±1.45 2.69±1.43 1.71±0.78 t-20.492 -6.205 -1.942 -14.920 -8.663 P＜0.01 ＜0.01 0.0557 ＜0.01 ＜0.01

表6 治療前、治療第4周、第8周PASI積分比較（）分

表6 治療前、治療第4周、第8周PASI積分比較（）分

注：經(jīng)配對t檢驗，治療前后患者PASI評分差異有統(tǒng)計學意義（t=-10.912，P=0.00）。

n 治療前 治療第4周 治療第8周40 26.53±9.76 17.34±7.05 7.53±5.10

2.7 外周血PBMC及皮損組織中 miR-155與相關因子基因表達水平等的相關性 PV患者外周血PBMC及皮損組織中 miR-155與RORγt、IL-17mRNA水平均呈正相關，且與PASI 評分呈正相關，而與SOCS1呈負相關，血漿中IL-17、IL-6、IL-23水平也與miR-155水平及 PASI評分呈正相關。

2.8 不良反應 觀察組有2人服藥初期出現(xiàn)惡心和輕度胃部不適，反應較輕微、能耐受，沒有影響繼續(xù)治療。治療結(jié)束后未見明顯血、尿常規(guī)及肝腎功能異常。

3 討論

銀屑病是一種常見慢性、紅斑鱗屑性、炎癥性皮膚病，中醫(yī)稱“白疕”。本病發(fā)病機制目前尚不明確，臨床上缺乏特效和徹底的治療方法。西醫(yī)多采用免疫抑制劑、激素類、維甲酸類等藥物或光療治療本病，可以控制皮疹，但復發(fā)也較快，而且存在不同程度的副作用，所以如何控制銀屑病的復發(fā)成為本病治療的難點與關鍵。目前臨床上大多是通過延長緩解期來減少復發(fā)，而諸多研究表明，中醫(yī)藥在銀屑病的治療尤其是控制復發(fā)及藥物安全性上具有明顯優(yōu)勢。

銀屑病發(fā)病機制中重要的三個中心環(huán)節(jié)是炎癥反應、表皮細胞過度增殖、免疫學異常。研究表明，miRNAs可以通過促進炎癥反應、調(diào)控細胞增殖分化以及影響基因甲基化等方面參與皮膚的生理病理，從而參與炎癥性疾病的發(fā)病過程［8］。現(xiàn)有研究已經(jīng)證實，Th17細胞及IL-23/IL-17軸在銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮著關鍵性作用，并成為了新的治療靶點［4-5］。在中國已經(jīng)上市的生物制劑烏司奴單抗和司庫奇尤單抗、依奇珠單抗，就是分別靶向中和IL-12和IL-23的共同亞單位p40和IL-17A的人源化IgG單克隆抗體，通過阻斷幼稚T淋巴細胞向Th1及Th17分化，高度選擇性抑制IL-17A激活角質(zhì)形成細胞與產(chǎn)生炎癥反應，而在銀屑病的治療中取得較好的療效。Th17細胞及相關因子在銀屑病患者的外周血PBMC和皮損中均存在高表達水平，RORγt是控制Th17分化的特征性轉(zhuǎn)錄因子［9］，Th17細胞被活化后釋放的IL-17、IL-22、IL-23、IFN-α等細胞因子，可刺激上皮角質(zhì)形成細胞，使其產(chǎn)生炎性增殖，從而促進銀屑病病程發(fā)展［10］。越來越多的研究表明，miR-155是促使Th17細胞發(fā)揮效應的一個重要調(diào)節(jié)因子。Hu等［11］研究顯示，miR-155通過促進Th17細胞相關效應基因表達的方式潛在地參與實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病機制。Rui等［12］研究發(fā)現(xiàn)，SOCS1作為JAK/STAT信號通路的負調(diào)控因子，鼠脾臟的CD4+T細胞中miR-155可以抑制靶基因SOCS1的表達，從而起到促進Th17細胞分化的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，在miR-155缺陷的Th17細胞中，Ets-1水平存在高表達，可以促進IL-23與其受體相結(jié)合，進而促進Th17細胞的分化［13］。這表明在自身免疫病中miR-155可以促進Th17分化，并且調(diào)節(jié)其功能，是Th17細胞增殖分化及功能的一個重要調(diào)節(jié)因子。據(jù)此推測，miRNA可能通過調(diào)控Th17而影響銀屑病的發(fā)病。本課題組［6，14］既往諸多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155在PV患者皮損及外周血清PBMCs、CD4+T淋巴細胞中存在特異性表達，而miRNA-155可以直接作用于靶基因SOCS1，影響JAK/STAT信號傳導通路中STAT3的表達，從而調(diào)控Th17細胞的分化及相關因子的表達，進而參與銀屑病的發(fā)病機制。本研究結(jié)果表明，PV患者外周血PMBC中miR-155、RORγt、IL-17mRNA基因表達、及Th17細胞比例、血漿中IL-17、IL-6和IL-23含量顯著高于健康人群，SOCS1低于正常人；PV患者皮損組織中的miR-155、RORγt及IL-17mRNA基因表達＞皮損周圍組織＞健康正常皮膚組織，SOCS1反之；PV 患者外周血PBMC中miR-155與RORγt、IL-17mRNA、Th17細胞相關因子均呈正相關，與PASI 評分呈正相關，與SOCS1負相關，血漿中IL-17、IL-6、IL-23水平也與miR-155水平及 PASI評分呈正相關。證實了在PV患者疾病過程中，miRNA155-SOCS1軸通過調(diào)控Th17細胞相關因子的分化及功能，從而參與PV的發(fā)病，促進PV病情進展。

臨床上PV進展期以血熱證型最為多見。歐陽恒教授根據(jù)銀屑病“血熱毒滯”這一病機而創(chuàng)立的竹黃湯，在數(shù)十年的臨床運用中已被證實療效顯著且安全性高。竹黃顆粒是由竹黃湯化裁而來，由竹葉、黃連、梔子、黃柏、水牛角、石膏、麥冬、黨參、漏蘆、山藥、三七等組成，具有清熱解毒、活血涼血、益氣養(yǎng)陰之功效。經(jīng)竹黃顆粒治療后，PV患者PASI評分明顯下降，療效顯著，且研究顯示治療后PV患者miR-155、IL-17mRNA、Th17細胞比例及血漿中IL-17含量顯著下調(diào)，SOCS1上調(diào)。其可能是通過調(diào)節(jié)miRNA155-SOCS1軸的表達，減少Th17細胞分化，降低PV患者Th17細胞相關因子水平，從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本研究顯示miRNA155-SOCS1軸與Th17細胞及其相關因子均參與了銀屑病的發(fā)病過程，且在其中發(fā)揮重要作用。應用竹黃顆粒治療PV療效顯著，可調(diào)節(jié)miRNA155、SOCS1、Th17細胞比例及IL-17等相關因子的表達水平，為銀屑病的中醫(yī)藥治療及新藥研發(fā)提供相關理論和實驗依據(jù)。由于經(jīng)費、實驗條件等多方面的限制，未能進行miRNA155-SOCS1軸調(diào)控Th17細胞的動物實驗及靶基因的驗證實驗，有待今后進一步研究。