王 超，徐東芳，彭遠遠，王 慶

安徽省胸科醫(yī)院檢驗科，安徽合肥 230022

結(jié)核性胸膜炎是肺外結(jié)核中常見的一種疾病，該病隱匿性較強，病程長，若不及時進行臨床診斷，可能導(dǎo)致患者錯過最佳治療時機，因此，結(jié)核性胸膜炎快速、準(zhǔn)確的診斷具有重要意義。但目前臨床診斷仍存在很多問題，如診治能力不足、診斷技術(shù)落后，防控系統(tǒng)“防治分離”、傳播途徑難控制、宿主免疫功能降低等[1]，最終導(dǎo)致漏診、誤診現(xiàn)象頻發(fā)。刺激性干咳、患側(cè)胸痛、積液增多是發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎的重要線索，單純的臨床體征并不能準(zhǔn)確診斷疾病，常結(jié)合胸部影像學(xué)、流行病學(xué)和臨床表現(xiàn)等進行診斷，但以上均不能作為診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，進一步加大了臨床診斷的難度。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進步，結(jié)核性胸膜炎的診斷以細菌學(xué)實驗室檢查為主，交叉引物恒溫擴增(TB-CPA)法、液體培養(yǎng)法、傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法是臨床上常見的幾種診斷結(jié)核性胸膜炎的方法，但液體培養(yǎng)法耗時較長，而傳統(tǒng)PCR法對儀器、設(shè)備等要求較高，并且操作難度相對較大。近年來，TB-CPA法得以廣泛使用，具備快速、簡便、靈敏度高等優(yōu)點。本研究主要探討TB-CPA法、液體培養(yǎng)法及傳統(tǒng)PCR法在結(jié)核性胸膜炎臨床診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2017年6月至2019年6月接收的119例胸腔積液患者作為研究對象，其中男79例，女40例，年齡43～64歲，平均(53.5±10.5)歲。參照《臨床診療指南：結(jié)核病分冊》2015年修訂版[2]確診為結(jié)核性胸膜炎的患者共101例，患者表現(xiàn)出中度發(fā)熱，且經(jīng)生化、超聲波檢查及胸膜活檢等做出診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均有胸腔積液體征且經(jīng)影像學(xué)檢查顯示胸腔積液征象，伴隨干咳、發(fā)熱、胸痛、呼吸困難等癥狀；(2)患者及家屬均對本研究知情；(3)患者自愿參加本研究；(4)患者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受抗結(jié)核治療時間大于2周；(2)嚴(yán)重臟器或心腦血管疾?。?3)慢性病史；(4)精神意識障礙，無法配合本研究；(5)不能明確診斷。本研究已獲本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2方法 本研究所選119例患者的胸腔積液均由臨床醫(yī)生抽取，分別采用TB-CPA法、液體培養(yǎng)法及傳統(tǒng)PCR法進行診斷，具體操作如下。TB-CPA法：選擇EasyNAT?-Pure20B全自動核酸提取儀提取結(jié)核分枝桿菌DNA，取適量標(biāo)本并加入等倍體積的4%NaOH溶液進行消化處理，吸入1.5 mL離心管，12 000 r/min離心10 min后提取DNA作為模板并對其進行核酸恒溫擴增，完成擴增后取出反應(yīng)管并將其置入一次性防污染檢測裝置扣緊，約2 min讀取結(jié)果[3]。結(jié)果判定：(1)若僅檢測線T出現(xiàn)，或檢測線T、質(zhì)控線C同時出現(xiàn)，則說明標(biāo)本中含有結(jié)核分枝桿菌，其水平達到或超過試劑盒最低檢測限，判定為陽性；(2)若僅質(zhì)控線C出現(xiàn)，則說明標(biāo)本中不含有結(jié)核分枝桿菌，其水平低于試劑盒最低檢測限，判定為陰性；(3)若檢測線T、質(zhì)控線C均未出現(xiàn)，則說明結(jié)果無效。出現(xiàn)無效結(jié)果的原因可能是由于擴增過程中有擴增抑制物出現(xiàn)，也可能是由于操作誤差或試劑盒損壞[4]。若結(jié)果顯示無效，首先應(yīng)查找導(dǎo)致無效結(jié)果的原因，排除人為操作因素后檢查是否存在擴增抑制物。液體培養(yǎng)法：使用美國BD公司的BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)儀，按實驗操作程序前處理標(biāo)本，將其接種于液體培養(yǎng)基中并放入儀器，待儀器出現(xiàn)陽性報警，取出培養(yǎng)基，經(jīng)涂片抗酸染色顯示為陽性，結(jié)核膠體金檢測為陽性，顯示革蘭染色無雜菌生長，則確定為結(jié)核分枝桿菌生長[5]。傳統(tǒng)PCR法：選擇廣州達安基因工程有限公司的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，按相關(guān)操作程序前處理標(biāo)本，提取結(jié)核分枝桿菌DNA，并使用ABI 7500熒光PCR擴增檢測儀進行檢測，儀器由美國ABI公司提供。注意嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作要求[6]。

1.3觀察指標(biāo) (1)對比3種方法結(jié)核性胸膜炎陽性檢出率情況。(2)對比3種方法診斷結(jié)核性胸膜炎的準(zhǔn)確性、靈敏度、特異度情況[7]。(3)根據(jù)3種方法的靈敏度和特異度繪制成受試者工作特征曲線(ROC曲線)，以診斷陽性為狀態(tài)變量擬合ROC曲線，計算ROC曲線下面積(AUC)。

2 結(jié) 果

2.13種方法結(jié)核性胸膜炎陽性檢出率比較 119例患者中，確診為結(jié)核性胸膜炎患者共101例。TB-CPA法的結(jié)核性胸膜炎陽性檢出率為74.26%(75/101)，較液體培養(yǎng)法(40.60%,41/101)、傳統(tǒng)PCR法(61.39%,62/101)更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.23種方法診斷效能的準(zhǔn)確性、靈敏度、特異度比較 TB-CPA法診斷準(zhǔn)確性為74.26%，靈敏度為71.26%，特異度為63.52%，較液體培養(yǎng)法(40.60%、53.18%、32.74%)及傳統(tǒng)PCR法(61.39%、64.09%、49.38%)更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3種方法診斷效能的準(zhǔn)確性、靈敏度、特異度比較(%)

2.33種方法ROC曲線分析結(jié)果比較 TB-CPA法、液體培養(yǎng)法、傳統(tǒng)PCR法診斷ROC曲線下面積分別為0.837、0.715、0.809，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

結(jié)核性胸膜炎屬于呼吸系統(tǒng)疾病范疇，是肺外結(jié)核中常見的一種類型。結(jié)核性胸膜炎是形成胸膜腔積液的最主要原因，臨床上結(jié)核性胸膜炎患者常以出汗、乏力、發(fā)熱等為主要癥狀，且表現(xiàn)出不同程度的呼吸困難或胸痛癥狀，若不及時診斷和治療，可損傷呼吸、循環(huán)系統(tǒng)，進而導(dǎo)致結(jié)核性膿氣胸、包裹性積液等[8]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2018年中國肺結(jié)核發(fā)病數(shù)為88.9萬例，居22個結(jié)核病高負擔(dān)國家的第2位，占全球結(jié)核病總發(fā)病率的9%[9]。結(jié)核具有較強傳染性，常通過呼吸道進行傳播，尤其當(dāng)人體免疫力下降時，若受到結(jié)核分枝桿菌感染，發(fā)病的概率更高。對于已感染結(jié)核分枝桿菌的患者來說，可導(dǎo)致抵抗力進一步降低，間接增強細胞介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，加重疾病的嚴(yán)重程度。對于結(jié)核性胸膜炎患者來說，若想改善預(yù)后，提高生存質(zhì)量，需要盡早診斷并采取治療措施干預(yù)。

現(xiàn)有的幾種結(jié)核性胸膜炎診斷技術(shù)中，液體培養(yǎng)法培養(yǎng)時間較長，無法滿足早期臨床診斷的需求，難以在臨床中得到廣泛使用，且液體培養(yǎng)法受多種因素的影響，診斷價值相對較低。傳統(tǒng)PCR法也受多種因素影響，尤其是易受到假陰性及假陽性診斷結(jié)果的困擾。根據(jù)臨床研究顯示，傳統(tǒng)PCR法出現(xiàn)假陰性結(jié)果的最主要原因是由于胸腔積液中存在細菌代謝產(chǎn)物或者標(biāo)本中含有TaqDNA酶抑制物、胸腔積液中菌量太少等，而出現(xiàn)假陽性結(jié)果的主要原因為實驗室污染及操作不規(guī)范導(dǎo)致的交叉串孔現(xiàn)象，因此，一旦操作過程中出現(xiàn)污染情況，就會出現(xiàn)誤診、漏診[10]。不可否認的是，以上2種方法都具備一定診斷價值，但無法滿足簡單、快速、準(zhǔn)確診斷的要求，實際臨床診療中需要尋求一種快速和靈敏的診斷方法。

近年來，TB-CPA法在臨床中得以廣泛使用。TB-CPA法靈敏度高，分析速度快，突變率低，不需要升降溫過程，對儀器要求低、成本低，且方便、快速。TB-CPA法10 min內(nèi)可快速提取核酸，并在等溫(63 ℃)下進行DNA擴增，耗時僅需60 min左右，且可直接目視判讀結(jié)果。DIEL等[11]研究提出，TB-CPA法通過添加不同活性的酶、各種特異性的引物，達到快速進行核酸擴增的目的。TB-CPA法具備獨特的優(yōu)勢，反應(yīng)過程始終維持在恒溫下。從成本效益方面來看，與傳統(tǒng)PCR法相比，TB-CPA法對于儀器的要求大大簡化，實驗過程只需要一個溫度，反應(yīng)時間大大縮短，更能滿足臨床診斷的需求，并且TB-CPA法還可有效解決實驗室污染的問題，預(yù)防核酸擴增物交叉污染現(xiàn)象的發(fā)生。分析其優(yōu)勢可以發(fā)現(xiàn)，TB-CPA法價格相對便宜，不需要分子實驗室及昂貴的儀器和設(shè)備，操作簡單，檢測試劑更易運輸，無需冷鏈，室溫即可，從標(biāo)本檢測到得出結(jié)果僅需120 min。

申潔等[12]研究顯示，2011年我國3家三級甲等醫(yī)院共收治957例結(jié)核患者，以L-J 培養(yǎng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，TB-CPA檢出結(jié)核分枝桿菌的準(zhǔn)確性高達90.50%，較熒光定量PCR 檢測結(jié)果更優(yōu)。本研究結(jié)果顯示，TB-CPA法的結(jié)核性胸膜炎陽性檢出率高于液體培養(yǎng)法與傳統(tǒng)PCR法，這一結(jié)果與李玉雪等[13]研究結(jié)果基本一致。王少華等[14]研究顯示，TB-CPA法診斷肺結(jié)核的靈敏度、特異度為85.50%、96.80%，在與實時熒光定量核酸擴增法等PCR方法的比較中，其占比最高。本研究中TB-CPA法診斷結(jié)核性胸膜炎準(zhǔn)確性、靈敏度、特異度較液體培養(yǎng)法、傳統(tǒng)PCR法均更高，與王少華等[14]研究結(jié)果一致，證實TB-CPA法是一種可靠實用的診斷方法，可作為診斷結(jié)核性胸膜炎的首選方式。同時，由于本研究中標(biāo)本數(shù)量選取存在一定的局限性，可能導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定偏差，后續(xù)臨床研究可提高標(biāo)本選取數(shù)量，使臨床研究準(zhǔn)確性進一步提高，從而為臨床診斷和后期治療提供更可靠的依據(jù)。