周 卿，陸瑩華，燕 飛

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物分析教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院2014級(jí)學(xué)生，貴州 遵義 563099)

在失眠癥狀的治療方法中，中醫(yī)藥治療因具有療效穩(wěn)定，安全、無(wú)毒、副作用小等特點(diǎn)而日益成為臨床常用的手段之一。大量研究也顯示，許多中草藥具有天然的鎮(zhèn)靜安神及催眠的功效，可以較好地調(diào)節(jié)睡眠功能[1-4]。復(fù)方鉤藤口服液由鉤藤、天麻、酸棗仁、遠(yuǎn)志、山萸肉5味藥材組成，是地方名醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)多年臨床使用，療效明確，具有較好地改善睡眠的作用，為方便藥物的服用，經(jīng)劑型改進(jìn)為口服液制劑。組方中鉤藤味甘性涼，可清熱平肝，息風(fēng)定驚，具有鎮(zhèn)靜，降壓作用[5-7]。天麻甘平柔潤(rùn)，亦可息風(fēng)定驚，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗焦慮功效，二者為主藥，合用可平肝息風(fēng)，鎮(zhèn)靜安神[8-10]；輔以的酸棗仁是鎮(zhèn)靜助眠佳品，甘酸質(zhì)潤(rùn)，可養(yǎng)血補(bǔ)肝[11-12]；遠(yuǎn)志味苦性溫，常用于心腎不交引起的失眠多夢(mèng)，健忘驚悸的治療等[13]；山萸肉可補(bǔ)益肝腎，收斂固澀；幾味藥合用可起到寧心除煩、鎮(zhèn)靜安神的功效。為保證臨床用藥的安全性和可控性，本研究采用薄層色譜法對(duì)復(fù)方鉤藤口服液中的鉤藤、天麻和酸棗仁進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜法測(cè)定該口服液中的鉤藤堿和天麻素的含量，以期較全面有效地控制、評(píng)價(jià)復(fù)方鉤藤口服液的質(zhì)量[14]。

1 材料

1.1 儀器 RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；安捷倫1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；pH計(jì)(美國(guó)EUTEOH公司)；BT125D型分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SG3300HE型超聲清洗儀(上海冠特有限公司)；ZF-7型暗箱三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑 復(fù)方鉤藤口服液(遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)20170721、20170805、20170827，規(guī)格：10mL/只)；鉤藤堿(批號(hào)：150907)，異鉤藤堿(批號(hào)：16032)，天麻素(批號(hào)：150518)，酸棗仁皂苷A(批號(hào)：160513)，酸棗仁皂苷B(批號(hào)：160820)，鉤藤對(duì)照藥材(批號(hào)：121190)均購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；鉤藤藥材購(gòu)自貴州省劍河縣，天麻、酸棗仁、遠(yuǎn)志、山萸肉、甘草藥材均購(gòu)自遵義中藥飲片公司，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科楊建文主任藥師鑒定為真品。甲醇、乙腈均為色譜純，購(gòu)自迪馬科技有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方鉤藤口服液的制備 取組方中的藥材加水浸泡30 min，以水為藥材質(zhì)量的12倍分別提取3次(鉤藤在第一次煎煮后20 min加入)，合并煎煮濾液，減壓濃縮至含生藥為1 g/mL，加乙醇至含醇量為70 %，醇沉24 h，過(guò)濾，減壓濃縮至無(wú)醇味，加水調(diào)節(jié)濃度至含生藥0.5 g/mL，放置15 h后，過(guò)濾，濾液用10 %氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為5.0，加入0.15 %的尼泊金甲酯和尼泊金乙酯的等量混合物，攪拌均勻，高溫滅菌，灌裝即得復(fù)方鉤藤口服液。

2.2 復(fù)方鉤藤口服液的定性鑒別

2.2.1 鉤藤藥材的鑒別 取鉤藤藥材粉碎，過(guò)40目篩，精密稱(chēng)取1.0 g，加入氨水1 mL浸泡30 min后，加入25.0 mL三氯甲烷加熱回流2 h，過(guò)濾，濾液蒸干，所得殘?jiān)?.0 mL甲醇溶解，作為鉤藤藥材的供試品溶液；另取鉤藤對(duì)照藥材1.0 g，采用上述鉤藤藥材供試品溶液制備方法得到鉤藤對(duì)照藥材溶液。精密取鉤藤堿、異鉤藤堿對(duì)照品，分別加甲醇溶解并定容配制成1.0 mg/mL溶液，作為鉤藤堿和異鉤藤堿的對(duì)照品溶液。分別吸取上述4種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一薄層硅膠G板上，以石油醚-丙酮(6∶4，V/V)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置于254 nm紫外光燈下檢視[15]。結(jié)果從色譜圖1可知，鉤藤藥材供試品溶液、鉤藤對(duì)照藥材溶液與其鉤藤堿和異鉤藤堿的對(duì)照品溶液在對(duì)應(yīng)位置上顯相同斑點(diǎn)。

1：鉤藤堿對(duì)照品；2：異鉤藤堿對(duì)照品；3：鉤藤藥材；4：鉤藤對(duì)照藥材。

2.2.2 口服液中鉤藤的鑒別 取復(fù)方鉤藤口服液20 mL，用氨水調(diào)節(jié)pH至10.0，加100 mL三氯甲烷，加熱回流1 h，取上層溶液重復(fù)用50 mL三氯甲烷加熱回流1 h，合并兩次下層溶液，蒸干后殘?jiān)?.5 mL甲醇溶解作為鉤藤供試品溶液。按復(fù)方鉤藤口服液的處方除去鉤藤后，制備缺鉤藤的陰性對(duì)照口服液，同上述方法制得缺鉤藤的陰性樣品溶液。取鉤藤堿、異鉤藤堿對(duì)照品，分別加甲醇溶解并定容配制成1.0 mg/mL的溶液，作為鉤藤堿和異鉤藤堿的對(duì)照品溶液。分別吸取上述4種溶液各10μL，點(diǎn)于同一薄層硅膠G板上，以石油醚-丙酮(6∶4,V/V)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干后置于254 nm紫外光燈下檢視[15]。結(jié)果從色譜圖2可知，復(fù)方鉤藤口服液與鉤藤堿和異鉤藤堿對(duì)照品溶液在對(duì)應(yīng)位置均顯相同斑點(diǎn)，而缺鉤藤的陰性對(duì)照溶液不顯斑點(diǎn)，不干擾測(cè)定。

1：鉤藤堿對(duì)照品；2：異鉤藤堿對(duì)照品；3～5：鉤藤供試品；6：陰性對(duì)照品。

2.2.3 口服液中天麻的鑒別 取復(fù)方鉤藤口服液10 mL，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解作為天麻供試品溶液。按復(fù)方鉤藤口服液的處方除去天麻后，制備缺天麻的陰性對(duì)照口服液，同上述方法制得缺天麻的陰性樣品溶液。精密稱(chēng)取天麻素對(duì)照品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的溶液，作為天麻素對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一薄層硅膠G板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(9∶1∶0.2，V/V/V)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸的乙醇溶液，于110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯清晰顏色[15]。結(jié)果從色譜圖3可知，復(fù)方鉤藤口服液與天麻素對(duì)照品溶液在對(duì)應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn)，缺天麻的陰性對(duì)照溶液不顯斑點(diǎn)，不干擾測(cè)定。

1：天麻素對(duì)照品；2～4：天麻供試品；5：陰性對(duì)照品。

2.2.4 口服液中酸棗仁的鑒別 取復(fù)方鉤藤口服液10 mL，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解作為酸棗仁供試品溶液。按復(fù)方鉤藤口服液的處方除去酸棗仁后，制備缺酸棗仁的陰性對(duì)照口服液，同上述方法制得缺酸棗仁的陰性樣品溶液。分別精密稱(chēng)取酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的對(duì)照品，分別用甲醇配制成1.0 mg/mL的溶液，作為酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B對(duì)照品溶液。分別吸取上述4種溶液各10μL，點(diǎn)于同一薄層硅膠G板上，以水飽和的正丁醇溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，于110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯清晰顏色[15]。結(jié)果從色譜圖4可知，復(fù)方鉤藤口服液與酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B對(duì)照品溶液在對(duì)應(yīng)位置顯相同斑點(diǎn)，而缺酸棗仁的陰性對(duì)照溶液不顯斑點(diǎn)，不干擾測(cè)定。

1：酸棗仁皂苷A對(duì)照品；2：酸棗仁皂苷B對(duì)照品;3～5：酸棗仁供試品；6：陰性對(duì)照品。

2.3 復(fù)方鉤藤口服液中鉤藤堿含量的測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A):0.05 %冰醋酸緩沖液(加三乙胺調(diào)節(jié)pH為7.5)(B)，梯度洗脫(0 min，40 % A；8 min，50 % A；20 min，60 %A；24 min，80 % A)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

2.3.2 溶液的配制 ①對(duì)照品溶液的配制：取鉤藤堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解并定容至10 mL，制成濃度為1.84 mg/mL的對(duì)照品溶液。②供試品溶液的配制：精密量取復(fù)方鉤藤口服液10.0 mL，經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，置于4 ℃條件下儲(chǔ)藏待用。③陰性對(duì)照溶液的配制：按復(fù)方鉤藤口服液的處方除去鉤藤后，按其制備工藝制成缺鉤藤的陰性樣品溶液，精密量取10.0mL經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，即得。

2.3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下各溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，色譜圖見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，鉤藤堿保留時(shí)間為9.7 min，理論塔板數(shù)按鉤藤堿峰計(jì)不低于3 000，分離度大于1.5，陰性對(duì)照溶液在鉤藤堿對(duì)照品相同保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明樣品中其它成分不干擾鉤藤堿的測(cè)定。

A：鉤藤堿對(duì)照品；B：復(fù)方鉤藤口服液；C：缺鉤藤陰性樣品；a：鉤藤堿。

2.3.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取鉤藤堿對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.92、3.68、7.36、11.04、14.78、18.40 μg/mL 的對(duì)照品系列溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜峰峰面積，以對(duì)照品溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，對(duì)照品的峰面積 A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，線(xiàn)性方程為A=46.36×C+13.44(r=0.999 2)，結(jié)果表明鉤藤堿在0.92 μg/mL～18.40μg/mL濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.5 定量限和檢測(cè)限的考察 精密量取鉤藤堿對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋定容配制成濃度為0.92 μg/mL 的溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)♂尯笕芤悍謩e在“2.3.1”色譜條件下進(jìn)樣分析測(cè)定，記錄峰面積，以信噪比為10∶1計(jì)算鉤藤堿的定量限，以信噪比為3∶1計(jì)算鉤藤堿的檢測(cè)限。結(jié)果，鉤藤堿的定量限為0.92 μg/mL，檢測(cè)限為0.18 μg/mL。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，配制成濃度為11.04 μg/mL的鉤藤堿對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)測(cè)定6次，以峰面積的RSD值表示精密度。結(jié)果，鉤藤堿峰面積的RSD值為0.20%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方鉤藤口服液(批號(hào)：20170805)6份，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以鉤藤堿含量的RSD值表示方法的重復(fù)性。結(jié)果，鉤藤堿含量的RSD值為2.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的復(fù)方鉤藤口服液9份(批號(hào)：20170805)，每份5.0 mL，分別加入高、中、低三種濃度的鉤藤堿對(duì)照品溶液適量，加甲醇定容至10 mL，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，分別按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取復(fù)方鉤藤口服液(批號(hào)：20170805)，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)，分別在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果，鉤藤堿峰面積的RSD值為1.85%，表明復(fù)方鉤藤口服液中鉤藤堿在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.10 樣品中鉤藤堿含量測(cè)定 取3批復(fù)方鉤藤口服液，按上述方法測(cè)定口服液中鉤藤堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2，可知3批復(fù)方鉤藤口服液中鉤藤堿的平均含量為13.69μg/mL。

2.4 復(fù)方鉤藤口服液中天麻素含量的測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶水(3∶97)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.4.2 溶液的配制 ①對(duì)照品溶液的配制：取天麻素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用蒸餾水溶解并定容至10 mL，制成濃度為2.65 mg/mL的對(duì)照品溶液；②供試品溶液的配制：精密量取1.0 mL復(fù)方鉤藤口服液，用蒸餾水稀釋10倍后，經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，置于4 ℃條件下儲(chǔ)藏待用；③陰性對(duì)照溶液的配制：按復(fù)方鉤藤口服液的處方除去天麻后，按其制備工藝制成缺天麻的陰性樣品溶液，精密量取1.0 mL用蒸餾水稀釋10倍后，經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，即得。

2.4.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下各溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，色譜圖見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，天麻素保留時(shí)間為8.7 min，理論塔板數(shù)按天麻素峰計(jì)不低于3 000，分離度大于1.5，陰性對(duì)照溶液在天麻素對(duì)照品相同保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明樣品中其它成分不干擾天麻素的測(cè)定。

A：天麻素對(duì)照品；B：復(fù)方鉤藤口服液；C：缺天麻陰性樣品；b：天麻素。

2.4.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取天麻素對(duì)照品溶液適量，用蒸餾水稀釋成質(zhì)量濃度分別為13.25、53.00、106.00、159.00、212.00、265.00 μg/mL 的對(duì)照品系列溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜峰峰面積，以對(duì)照品溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，對(duì)照品的峰面積 A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸,線(xiàn)性方程為A=35.17×C-8.39(r= 0.999 8)，結(jié)果表明天麻素在13.25 μg/mL～265.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4.5 定量限和檢測(cè)限的考察 精密量取天麻素對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋定容配制成濃度為13.25 μg/mL 的溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)♂尯笕芤悍謩e在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析測(cè)定，記錄峰面積，以信噪比為10∶1計(jì)算天麻素的定量限，以信噪比為3∶1計(jì)算天麻素的檢測(cè)限。結(jié)果，天麻素的定量限為1.33μg/mL，檢測(cè)限為0.26μg/mL。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.4.2”項(xiàng)下天麻素對(duì)照品溶液，配制成濃度為159.00μg/mL的天麻素對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積的RSD值表示精密度。結(jié)果，天麻素峰面積的RSD值為0.30%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方鉤藤口服液(批號(hào)：20170805)6份，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析測(cè)定，以天麻素含量的RSD值表示方法的重復(fù)性。結(jié)果，天麻素含量的RSD值為0.60%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的復(fù)方鉤藤口服液9份(批號(hào)：20170805)，每份5.0 mL，分別加入高、中、低三種濃度的天麻素對(duì)照品溶液適量，加蒸餾水定容至10 mL，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果(見(jiàn)表1)。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.4.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取量取復(fù)方鉤藤口服液(批號(hào)：20170805)，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)，分別在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析測(cè)定，天麻素峰面積的RSD值為0.99%，結(jié)果表明復(fù)方鉤藤口服液中天麻素在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.10 樣品中天麻素含量測(cè)定 取3批口服液，按上述方法測(cè)定口服液中天麻素的含量，結(jié)果見(jiàn)表2，可知3批復(fù)方鉤藤口服液中天麻素的平均含量為1294.6 μg/mL。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

鉤藤堿、異鉤藤堿均是鉤藤中的主要藥效成分，二者為同分異構(gòu)體，在煎煮過(guò)程中易相互轉(zhuǎn)換[16]，中國(guó)藥典中對(duì)于鉤藤藥材的定性鑒別僅采用了以異鉤藤堿為檢測(cè)指標(biāo)[15]，為全面控制鉤藤藥材的質(zhì)量，在本試驗(yàn)中同時(shí)定性鑒別了鉤藤堿和異鉤藤堿，采用紫外燈光觀察，結(jié)果表明兩個(gè)成分分離完全，斑點(diǎn)清晰。在鉤藤堿的含量測(cè)定方法中，比較了文獻(xiàn)中[17-19]的流動(dòng)相，如甲醇-0.02%三乙胺、甲醇-水(含0.01 mol/L三乙胺，冰醋酸調(diào) pH值至 7.5)、甲醇-水等均不能使口服液中的鉤藤堿與其他組分完全分離，后采用在0.05%的冰醋酸溶液中加入0.07%的氨水，再加三乙胺調(diào)節(jié)pH為7.5，鉤藤堿與口服液中其他組分得以分離完全。同時(shí)在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)異鉤藤堿的含量遠(yuǎn)低于鉤藤堿，故選擇鉤藤堿作為該口服液中含量測(cè)定的指標(biāo)之一。在天麻素的含量測(cè)定方法中，由于天麻素極性較大，所用流動(dòng)相的極性也較大，對(duì)常規(guī)色譜柱有損害，而選擇專(zhuān)用適合極性化合物分離的色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq較好地解決了這一問(wèn)題，且基線(xiàn)平穩(wěn)，色譜峰峰型良好。

綜上所述，本試驗(yàn)建立了復(fù)方鉤藤口服液中鉤藤堿、天麻素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的薄層色譜鑒別法；建立了復(fù)方鉤藤口服液中鉤藤堿、天麻素含量測(cè)定的高效液相色譜法，含量限度以-20%為下限[20]，再綜合考慮藥材來(lái)源的差異，確定口服液中鉤藤堿的含量不得低于10.0 μg/mL，天麻素的含量不得低于1 000.0 μg/mL。所建立的方法準(zhǔn)確可靠，可用于復(fù)方鉤藤口服液的質(zhì)量控制。