趙 玉，潘新宇，李 冀，于成龍，于建渤

(1.黑龍江省腫瘤疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院病理診斷中心，黑龍江 牡丹江 157011)

結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤(extranodal nasal type NK/T-cell lymphoma,ENKTCL-N)是一類具有特殊形態(tài)、免疫表型和生物學(xué)行為，并與EB病毒感染關(guān)系密切的侵襲性腫瘤。該腫瘤在西方國(guó)家少見(jiàn)，在亞洲、墨西哥和中南美洲等地區(qū)相對(duì)常見(jiàn)[1-3]。因此，進(jìn)一步從分子水平闡明該腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制能夠?yàn)榭鼓[瘤治療提供理論依據(jù)。順鉑是一種無(wú)機(jī)鉑衍生物，用于治療多種癌癥，包括膀胱癌、卵巢癌、肺癌和睪丸癌[4]。順鉑通過(guò)兩個(gè)氯化物離去基團(tuán)之一的水合而在細(xì)胞內(nèi)被激活，然后它與DNA加合物共價(jià)結(jié)合。DNA修飾激活多種細(xì)胞內(nèi)途徑，包括DNA損傷識(shí)別和修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯和程序性細(xì)胞死亡/凋亡[5-6]。本文通過(guò)檢測(cè)順鉑對(duì)人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK6和NK92的殺傷作用，探討順鉑的殺傷作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)胞株NK92(NK/T細(xì)胞淋巴瘤)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；SNK6細(xì)胞株(NK/T細(xì)胞淋巴瘤)為美國(guó)City of Hope National Medical Center陳榮宗教授贈(zèng)送；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco生物公司；人白細(xì)胞介素-2(IL-2)購(gòu)于R&D公司；增強(qiáng)型CCK-8購(gòu)于上海尚寶生物科技有限公司；順鉑(Cisplatin)和N,N-Dimethylformamide(DMF)購(gòu)于美國(guó)Selleck生物科技公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、CO2培養(yǎng)箱和7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NK92細(xì)胞株在含有10%的胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和100 U/mL IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。SNK6細(xì)胞株在含有10%的胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和600 U/mL IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。NK92和SNK6細(xì)胞均于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，更換培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 將細(xì)胞按照2×105細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640制成單細(xì)胞懸液，按梯度濃度加入順鉑，使其終濃度為2.5μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM，置于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別于培養(yǎng)后24h、48h和72h迅速加入10 μL增強(qiáng)型CCK-8試劑。37℃孵育4h，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)OD值。將各測(cè)試孔的OD值減去調(diào)零孔OD值。各平行孔的OD值取平均數(shù)。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(加藥組OD平均值/對(duì)照組OD均值)×100%。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)順鉑處理后凋亡相關(guān)基因和JAK3、STAT3的表達(dá) 按照E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit說(shuō)明書(shū)從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離總RNA。將1μg總RNA利用Transcriptor First Strand cDNA試劑盒合成cDNA第一條鏈，利用Fast SYBR green PCR master mix(Roche)通過(guò)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)條件如下：20μL反應(yīng)體系，95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃退火1min，72℃延伸10min。進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，依據(jù) 2-△△CT法計(jì)算各樣本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。GAPDH為內(nèi)參基因。

表1 RT-qPCR引物序列

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間差異性比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株培養(yǎng)情況和形態(tài)觀察鏡下，SNK6和NK92細(xì)胞均在培養(yǎng)基中成簇、懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為圓形或類圓形，狀態(tài)良好(見(jiàn)圖1)。

圖1 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(A、C：×200;B、D：×400)

2.2 順鉑對(duì)SNK6和NK92細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果顯示，順鉑用藥組對(duì)SNK6和NK92細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。隨著順鉑濃度的增加，各組細(xì)胞的活性的抑制率均顯著增加(P<0.05)。同一用藥組內(nèi)順鉑作用時(shí)間越長(zhǎng)，SNK6和NK92細(xì)胞的存活率均越低(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖2 順鉑對(duì)SNK6和NK92細(xì)胞增殖的抑制作用

2.3 RT-qPCR檢測(cè)順鉑處理后Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)順鉑用藥后SNK6和NK92細(xì)胞的促凋亡基因Bax表達(dá)增加，而凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)減少，且順鉑高劑量組細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)應(yīng)低劑量用藥組。兩組間的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A：7.5μM組t=15.28，P=0.0043，15μM組t=22.64，P=0.0019，B：7.5μM組t=19.11，P=0.0027，15μM組t=27.79，P=0.0013，C：7.5μM組t=16.59，P=0.0036，15μM組t=27.95，P=0.0013，D：7.5μM組t=18.97，P=0.0028，15μM組t=28.18，P=0.0013)(見(jiàn)圖3)。

2.4 RT-qPCR檢測(cè)順鉑處理后JAK3和STAT3的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比，順鉑處理后NK92細(xì)胞中JAK3和STAT3的表達(dá)減少。兩組間的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A：5μM組t=24.28，P=0.0017，20μM組t=24.57，P=0.0017，B：5μM組t=15.51，P=0.0041，20μM組t=21.00，P=0.0023，C：5μM組t=14.34，P=0.0048，20μM組t=21.45，P=0.0022)(見(jiàn)圖4)。

圖4 順鉑處理后JAK3、STAT3的mRNA表達(dá)

3 討論

結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)展快，生存時(shí)間短，預(yù)后差，可通過(guò)早期診斷和早期治療加以改善[7]。大多數(shù)抗癌療法，包括藥物和化學(xué)療法，都是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)靶向癌細(xì)胞的[8]。凋亡被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)育、分化和死亡中的重要現(xiàn)象。生理過(guò)程的失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞異常積累，被認(rèn)為是腫瘤形成的主要機(jī)制之一。細(xì)胞增殖和凋亡均是多因素的復(fù)雜過(guò)程，同時(shí)受到原癌基因和抑癌基因的雙向調(diào)控。BCL家族蛋白是維持線粒體功能和膜完整性所必需的。Bax和Bcl-2是BCL蛋白家族中最典型的成員，控制線粒體參與凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9-10]。Hogarth等[11]研究發(fā)現(xiàn)Bax的高表達(dá)與兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。Bax的高表達(dá)也與急性髓細(xì)胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤的不良預(yù)后有關(guān)[12-13]。而抗凋亡蛋白，如Bcl-2，通過(guò)隔離促凋亡蛋白發(fā)揮作用，阻止促凋亡蛋白與促凋亡激活因子Bax和/或Bak結(jié)合并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。

化療可能導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體釋放，激活caspase-3,PARP切割，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在生物膜中，Bcl-2可以形成離子通道，可以通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)膜的通透性并從而將線粒體內(nèi)容物釋放到細(xì)胞質(zhì)中來(lái)控制細(xì)胞凋亡[15]。Bcl-2蛋白家族控制死亡信號(hào)的幾個(gè)關(guān)鍵步驟，因?yàn)樗鼈兛梢员Ｗo(hù)細(xì)胞免受化療、放療或生長(zhǎng)因子剝奪引起的死亡[16]。

順鉑是一種以鉑為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物，是最廣泛使用的化療藥物之一。順鉑通過(guò)在細(xì)胞核DNA中形成鉑化產(chǎn)物發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。細(xì)胞死亡是由多種刺激導(dǎo)致的，包括細(xì)胞外(細(xì)胞因子激活死亡受體)和細(xì)胞內(nèi)(ROS介導(dǎo)的線粒體損傷)[18]。順鉑可破壞線粒體動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致線粒體破碎，細(xì)胞損傷甚至死亡[19]。順鉑在體外誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制是劑量依賴性的，低劑量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，高劑量誘導(dǎo)壞死[20-21]。不少研究報(bào)道表明抗凋亡線粒體蛋白Bcl-2在順鉑的作用下被下調(diào)[19,22-23]。

JAK/STAT通路密切參與了淋巴瘤的病理過(guò)程，JAK通路的異?；罨赥細(xì)胞淋巴瘤形成和化療耐藥中發(fā)揮重要作用。STAT3是轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，它介導(dǎo)對(duì)多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的應(yīng)答，并調(diào)節(jié)參與調(diào)節(jié)多種重要功能的基因的轉(zhuǎn)錄，主要包括細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移、遷移、血管生成，化療耐藥與免疫應(yīng)答[24]。Chen等[25]研究發(fā)現(xiàn)PTPRK與STAT3結(jié)合并在Tyr705處直接使p-STAT3去磷酸化。位于缺失的6q區(qū)域的PTPRK丟失會(huì)導(dǎo)致STAT3活化，并參與鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病。Montes-Mojarro等[26]通過(guò)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，STAT3突變病例顯示出均一且強(qiáng)烈p-STAT3染色，相比之下，STAT3野生型病例顯示p-STAT3異質(zhì)且較弱的染色，提示STAT3突變被預(yù)測(cè)為組成性激活的STAT3蛋白。此外，Sun等[27]研究表明，miR-10a可以促進(jìn)Smad2，STAT3和STAT5以及HIF和eIF4E的下游轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而在A549細(xì)胞中誘導(dǎo)順鉑(DDP)抗性。抑制STAT3信號(hào)傳導(dǎo)可誘導(dǎo)原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞系凋亡并降低survivin表達(dá)，鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤中STAT3和survivin表達(dá)之間呈正相關(guān)[28]。之前的研究表明，抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)水平與p-STAT3水平呈正相關(guān)，提示STAT3激活通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族在抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)增殖中起關(guān)鍵作用[29-30]。與之前的研究一致，STAT3調(diào)節(jié)抗凋亡基因BCL-2家族的轉(zhuǎn)錄，順鉑處理可降低其在耳蝸中的表達(dá)水平[31-32]。Rosati等[33]通過(guò)Western blot分析發(fā)現(xiàn)，順鉑處理可降低UB/OC1細(xì)胞中STAT3及p-STAT3的表達(dá)，導(dǎo)致STAT3的失活。此外，通過(guò)免疫染色發(fā)現(xiàn)，順鉑治療降低了細(xì)胞核中p-STAT3的水平，表明順鉑可能會(huì)破壞STAT3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。本研究發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)SNK6和NK92細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于對(duì)照組，且具有時(shí)間和劑量依賴性。順鉑用藥后SNK6和NK92細(xì)胞的促凋亡基因Bax表達(dá)增加,而凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)減少，且順鉑高劑量組細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)應(yīng)低劑量用藥組，初步探討了順鉑對(duì)人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK6和NK92的殺傷作用。JAK/STAT 信號(hào)通路的磷酸化水平，標(biāo)志該通路的激活程度，因此抑制其磷酸化可以調(diào)節(jié)該通路活性，改善疾病。

綜上，順鉑誘導(dǎo)的STAT3失活可能損害抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑毒性作用的敏感性。順鉑可能誘導(dǎo)JAK/STAT信號(hào)通路中靶基因的調(diào)節(jié)(Bax，Bcl-2),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，提示順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能歸因于STAT3依賴性基因的上調(diào)或下調(diào)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。JAK3/STAT3途徑的抑制可以作為NK/T淋巴瘤的治療選擇。