劉長(zhǎng)兵，胡惠貞，黃海良

(1.宣城職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護(hù)學(xué)院，安徽 宣城 242000;2.安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部，安徽 池州 247100；3.安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

肝癌在全球癌癥發(fā)病率中居于第六位，其在癌癥死亡率中高居第四位[1]。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不佳和復(fù)發(fā)率高的最主要因素，該過(guò)程涉及很多內(nèi)外因素[2]。因此，深入探尋影響及決定肝癌早期轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)肝癌的臨床治療具有重要作用。

MicroRNAs(miRNAs)屬于內(nèi)源性非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平靶向調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)功能[3-4]。研究證實(shí)，MiR-22的表達(dá)失調(diào)與前列腺癌、乳腺癌、膽管癌、肝癌和多發(fā)性骨髓瘤均具有相關(guān)性[5-6]。然而，miR-22失調(diào)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制仍然難以捉摸。因此，我們通過(guò)構(gòu)建miR-22過(guò)表達(dá)載體并進(jìn)一步研究miR-22對(duì)肝癌的影響，為深入研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料dulbecco's modified eagle medium(DMEM)細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Gibico公司)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher公司)；Real-time PCR試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)；GAPDH、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-catenin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；蛋白提取及定量試劑盒、CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；ECL檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Affinity公司)；miR-22-3p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；Li-7細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.2 方法

1.2.1 miR-22-3p過(guò)表達(dá)細(xì)胞株建立 Li-7細(xì)胞置于37℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液、觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶時(shí)進(jìn)行傳代。按1×106/mL的標(biāo)準(zhǔn)將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，并按照l(shuí)ipofectamine 3000操作說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組(N)、陰性對(duì)照組(GV251/NC)和miR-22-3p過(guò)表達(dá)組(GV251/miR-22-3p)。轉(zhuǎn)染8h后按1∶4進(jìn)行細(xì)胞傳代，同時(shí)加入濃度為200μg/mL G418篩選出miR-22-3p過(guò)表達(dá)細(xì)胞株。

1.2.2 Real-time PCR Trizol法裂解并提取細(xì)胞總RNA，定量后以此為模板參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。具體反轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置如下：65℃，5min；42℃，60min；70℃，5min。反應(yīng)產(chǎn)物即為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。以上述反?yīng)產(chǎn)物為模板，應(yīng)用ABI 7500型Real-time PCR儀按下述反應(yīng)程序：95℃5s，60℃34s，設(shè)置循環(huán)數(shù)為40，檢測(cè)各目的基因Ct值。分析miR-22-3p時(shí)以U6為內(nèi)參，其它基因均以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法分析各基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.3 Western blot 參照RIPA(強(qiáng))細(xì)胞裂解液試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量并將各樣品蛋白濃度調(diào)整一致。按照SDS-PAGE操作進(jìn)行電泳，濕法轉(zhuǎn)膜后，應(yīng)用封閉工作液室溫封閉2.0h，TBST洗膜3min。參考抗體說(shuō)明書進(jìn)行抗體稀釋，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5min。相應(yīng)的IgG二抗室溫孵育1.5h，TBST洗膜3次，每次10min；ECL發(fā)光、顯影、曝光。應(yīng)用Quantity One灰度分析軟件檢測(cè)各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，各蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.2.4 CCK8實(shí)驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后按2×103/孔的量將其接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按照CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行相應(yīng)操作，分別與細(xì)胞培養(yǎng)后0h、24h、48h和72h加入10μL CCK8，并使用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值，并計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞增殖率。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 根據(jù)檢測(cè)時(shí)效安排，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞按1×106/孔的量接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合度為60%時(shí)應(yīng)用Φ1.0μm的細(xì)胞劃痕器垂直于細(xì)胞培養(yǎng)板在每孔劃出3條平行線，DMEM培養(yǎng)基洗去脫落細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察、拍照，即為0h細(xì)胞劃痕寬度。然后繼續(xù)培養(yǎng)24和48h，并分別進(jìn)行拍照。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量每孔多個(gè)點(diǎn)劃痕間距，計(jì)算細(xì)胞遷移率，即細(xì)胞遷移率=(劃痕寬度0h-劃痕寬度24h/48h)/劃痕寬度0h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-22-3p過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的建立經(jīng)過(guò)8周濃度為200μg/mL的G418篩選后，成功建立miR-22-3p過(guò)表達(dá)Li-7細(xì)胞株。Real-time PCR檢測(cè)表明，N組、GV251/NC組和GV251/miR-22-3p組miR-22-3p的表達(dá)水平分別為(1.076±0.210)、(1.083±0.222)和(32.401±4.668)。見圖1。

圖1 Real-time PCR檢測(cè)miR-22-3p表達(dá)

2.2 miR-22-3p過(guò)表達(dá)對(duì)Li-7細(xì)胞增殖能力的影響CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及分析結(jié)果表明，與N組和GV251/NC組相比，GV251/miR-22-3p組在48h、72h和96h細(xì)胞增殖率均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.277，P<0.01；F=3.443，P<0.01；F=5.278，P<0.01)。見圖2。

圖2 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

2.3 miR-22-3p過(guò)表達(dá)對(duì)Li-7細(xì)胞遷移能力的影響測(cè)量0h和48h兩組細(xì)胞劃痕寬度，比較分析不同組別細(xì)胞在48h的遷移率。結(jié)果顯示，與N、GV251/NC組相比，GV251/miR-22-3p組細(xì)胞遷移率明顯降低，遷移能力顯著減弱(F=5.843，P<0.01)。見圖3。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

2.4 miR-22-3p過(guò)表達(dá)對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響經(jīng)Real-time PCR和Western blot檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析表明，與N組和GV251/NC組相比，GV251/miR-22-3p組Bcl-2基因mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(F=2.175，P<0.01；F=5.789，P<0.01)，而Bax基因mRNA和蛋白表達(dá)則明顯升高(F=6.737，P<0.01；F=1.674，P<001)。見圖4。

圖4 Real-time PCR和Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax表達(dá)

2.5 miR-22-3p過(guò)表達(dá)對(duì)EMT標(biāo)志性基因mRNA表達(dá)的影響Real-time PCR分析結(jié)果表明，與N組和GV251/NC組相比，GV251/miR-22-3p組上皮標(biāo)志性基因E-cadherin和β-catenin的mRNA表達(dá)均顯著升高(F=17.520，P<0.01；F=43.920，P<0.01)，同時(shí)間質(zhì)標(biāo)志性基因N-cadherin和Vimentin的mRNA表達(dá)則明顯降低(F=3.332，P<0.01；F=3.981，P<0.01)。見圖5。

圖5 Real-time PCR檢測(cè)EMT標(biāo)志性基因mRNA的表達(dá)

2.6 miR-22-3p過(guò)表達(dá)對(duì)EMT標(biāo)志性基因蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)及灰度結(jié)果分析顯示：與N組和GV251/NC組相比，GV251/miR-22-3p組上皮標(biāo)志性基因E-cadherin和β-catenin的蛋白表達(dá)均顯著升高(F=2.124，P<0.01；F=2.810，P<0.01)，同時(shí)間質(zhì)標(biāo)志性基因N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)則明顯降低(F=6.360，P<0.01；F=1.249，P<0.01)。見圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)EMT標(biāo)志性基因蛋白的表達(dá)

3 討論

MiR-22是一種新型的小單鏈非編碼RNA，可靶向調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平發(fā)揮生物學(xué)功能[7-8]。研究表明，miR-22在不同的腫瘤中可表現(xiàn)出促癌或抑癌的不同效果[9]。Zhang[10]等研究表明，miR-22可通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控SIRT1，激活P53及其下游相關(guān)基因P21和PUMA，同時(shí)通過(guò)切割凋亡相關(guān)因子Caspase-3和PARP，進(jìn)而抑制腎細(xì)胞癌EMT，降低腫瘤的增殖、侵襲和遷移[7]。Zhang[11]等研究證實(shí)，miR-22在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)的癌旁組織，并且其低表達(dá)亦導(dǎo)致患者的預(yù)后不良。并且，miR-22可通過(guò)靶向調(diào)控HDAC4抑制肝癌細(xì)胞的增殖和致瘤性。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-22-3p可降低肝癌Li-7細(xì)胞的增殖能力。同時(shí)，miR-22-3p可抑制Bcl-2的表達(dá)及促進(jìn)Bax的表達(dá)，這表明miR-22-3p可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制Li-7細(xì)胞增殖。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移方面具有重要的作用，EMT的程度越高細(xì)胞的侵襲和遷移能力越強(qiáng)[12-13]。其中，上皮性標(biāo)志基因E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和β-鏈蛋白(β-catenin)降低的程度以及間質(zhì)性標(biāo)志基因N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)增加的多少是反應(yīng)EMT的重要指標(biāo)。EMT可降低腫瘤細(xì)胞間的黏附能力，增加腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和形成轉(zhuǎn)移灶的能力[14-15]。同樣，本研究表明過(guò)表達(dá)miR-22-3p可抑制Li-7細(xì)胞EMT，降低細(xì)胞的遷移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，將為肝癌的臨床治療提供新思路。

然而，miR-22-3p是如何靶向調(diào)控下游基因以及通過(guò)哪些信號(hào)通路促進(jìn)Li-7細(xì)胞增殖和遷移等仍需要深入研究。