郭建宇，齊寶林，齊曉軒

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

肺癌是迄今為止全球癌癥死亡的主要原因。腺癌是肺癌的重要病理類型，其發(fā)病年齡普遍低于鱗癌和小細(xì)胞癌，多為周圍型，且發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)超越鱗癌成為最常見的肺癌，大約占肺癌的30%～40%。CTC是從原發(fā)性腫瘤和或轉(zhuǎn)移性病變中脫落并在血流中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[1]。有研究表明外周血CTCs細(xì)胞數(shù)量是惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2-3]。通過檢測外周血中CTC是一種無創(chuàng)且操作簡單的方法。目前一些研究已明確表明動(dòng)態(tài)監(jiān)測循環(huán)腫瘤細(xì)胞對(duì)評(píng)估肺腺癌患者的預(yù)后及治療效果有重要意義。本研究采用免疫磁珠法對(duì)肺腺癌患者圍術(shù)期外周血CTCs動(dòng)態(tài)監(jiān)測，并對(duì)比分析微創(chuàng)肺腺癌切除術(shù)組和開放肺腺癌切除術(shù)組對(duì)圍術(shù)期CTCs動(dòng)態(tài)變化的影響，為臨床患者選擇微創(chuàng)或開放式手術(shù)以及對(duì)術(shù)后患者的治療效果的評(píng)估提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 一般資料收集我院自2018年7月至2019年11月間來本院行肺癌根治術(shù)的肺腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)前影像學(xué)檢查頭部胸部CT腹部彩超等提示有手術(shù)指征并且沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)移；(2)手術(shù)前的一般檢查血常規(guī)，生化常規(guī)，心臟彩超，肺功能，血?dú)夥治龅葘?duì)肺腺癌切除術(shù)無手術(shù)禁忌；(3)根據(jù)手術(shù)前胸部CT，三維重建等檢查，腫瘤最長橫徑≤7cm且無外侵；(4)無因肺裂發(fā)育不全及粘連導(dǎo)致手術(shù)時(shí)間延長；(5)術(shù)前未接受新輔助治療的患者；(6)術(shù)后病理結(jié)果由最新肺癌指南分期的TNM分期進(jìn)行分期；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不能耐受肺腺癌切除術(shù)；(2)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或其他器官發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤。(3)手術(shù)資料不全。最終共納入61例，其中31例微創(chuàng)手術(shù)患者，30例開放手術(shù)患者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)過患者及家屬同意。

1.2 手術(shù)方法微創(chuàng)組和開放組均為同一位手術(shù)醫(yī)師。微創(chuàng)肺腺癌切除術(shù)：全身麻醉單孔胸腔鏡下，先打開肺裂，游離切斷肺靜脈，游離肺動(dòng)脈并離斷，分離組織后切斷支氣管，切除游離肺葉的同時(shí)清掃肺內(nèi)及肺門部位的淋巴結(jié)，肺葉切除標(biāo)本取出后系統(tǒng)性清掃縱隔淋巴結(jié)。開放肺腺癌切除術(shù)：全身麻醉下，先打開肺裂，游離切斷肺靜脈，游離肺動(dòng)脈并離斷，分離組織后切斷支氣管，切除游離肺葉的同時(shí)清掃肺內(nèi)及肺門部位的淋巴結(jié)，肺葉切除標(biāo)本取出后系統(tǒng)性清掃縱隔淋巴結(jié)。

1.3 檢測方法所有患者分別于術(shù)前3d，手術(shù)中腫瘤切除及淋巴結(jié)清掃完畢后，手術(shù)后3d，采集外周靜脈血7.5mL于枸櫞酸抗凝管中，室溫保存。12h內(nèi)室溫800r/s離心6min,用巴氏滴管吸取中間層。1mL細(xì)胞懸液加入4mL紅細(xì)胞裂解液(1:4～1:5)，充分混勻置于室溫孵育，10min后待樣本呈透明紅色，室溫離心機(jī)300r/s離心10min，吸取裂解液并丟棄。加入400μL PBS緩沖液，室溫800r/s離心5min，棄去裂解液，加入400μL PBS緩沖液重懸，獲得單個(gè)核細(xì)胞。對(duì)樣本進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入CD326(上皮細(xì)胞黏附因子)免疫磁珠和Fc受體阻斷劑,置于4℃恒溫箱中孵育，30min后加入MS柱,收集經(jīng)吸附的陽性部分細(xì)胞。洗滌重懸后再加入細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK-PE)和 CD45-FITC熒光單克隆抗體,混勻后置于4℃恒溫箱孵育30min后,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。同時(shí)滿足CK-PE標(biāo)記陽性，CD45-FITC標(biāo)記為陰性的細(xì)胞即為CTCs。CTCs陽性標(biāo)準(zhǔn)為CTCs≥3個(gè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)”差表示。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用t檢驗(yàn)和方差分析，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)?？ǚ綑z驗(yàn)分析兩組一般資料，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肺腺癌患者一般資料比較兩組分別由31例和30例肺腺癌患者組成，其中微創(chuàng)肺腺癌根治術(shù)組男性20例，女性11例，平均年齡(60.61±7.66)歲；開放肺腺癌根治術(shù)組男性16例，女性14例，平均年齡(59.13±8.97)歲。微創(chuàng)組和開放組在性別、有無吸煙史、術(shù)后TNM分期等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 兩組肺腺癌患者術(shù)前CTCs檢測比較61例肺腺癌患者中，術(shù)前3d CTCs檢測陽性率57.4%(35/61)。微創(chuàng)組肺腺癌切除術(shù)組陽性率54.8%(17/31),開放組肺腺癌切除術(shù)組陽性率60.0%(18/30)。兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.166,P=0.684),見表1。

表1 兩組肺腺癌患者術(shù)前CTCs檢測比較

2.3 兩組肺腺癌患者不同手術(shù)階段CTCs水平的變化61例肺腺癌患者，肺腺癌切除術(shù)術(shù)中外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的水平高于術(shù)前(P<0.001),肺腺癌切除術(shù)后3日外周血CTCs水平高于術(shù)中(P<0.001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。微創(chuàng)肺腺癌切除術(shù)組和開放肺腺癌切除術(shù)組在術(shù)前3d和術(shù)中外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，微創(chuàng)肺腺癌切除組術(shù)后3d外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞水平明顯低于開放肺腺癌切除術(shù)組(P<0.05)。微創(chuàng)肺腺癌切除術(shù)組術(shù)前到術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞增幅水平明顯低于開放組(P<0.001)，見表2。

表2 兩組肺腺癌患者不同手術(shù)階段CTCs水平的變化

3 討論

目前，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展肺腺癌患者的治療已經(jīng)獲得巨大的進(jìn)展，一方面微創(chuàng)手術(shù)已進(jìn)入傳統(tǒng)開放手術(shù)領(lǐng)域，并且分子靶向藥物和免疫治療在肺腺癌治療中的應(yīng)用也日漸增多，但耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，使治療難度明顯加大，另一方面手術(shù)可以將腫瘤完整切除同時(shí)清掃淋巴結(jié)，故手術(shù)仍為治療本病的重要手段。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，以及胸腔鏡技術(shù)在胸外科領(lǐng)域的應(yīng)用，越來越多的研究人員開始探索微創(chuàng)技術(shù)對(duì)肺腺癌的治療效果。肺腺癌患者5年生存率仍不高，預(yù)后較差的主要原因是轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。通常用來判斷肺腺癌患者預(yù)后的主要因素是腫瘤病理分期，但腫瘤起病隱匿，即使發(fā)現(xiàn)也需手術(shù)后才能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其分期。處于輔助治療階段的腫瘤患者通常只能通過影像學(xué)檢查來評(píng)估患者治療情況。這些復(fù)雜的因素使得評(píng)價(jià)患者病情進(jìn)展具有一定局限性。近年來，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究越來越廣泛，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cell，CTC)，是由原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移病灶脫落的惡性腫瘤細(xì)胞。當(dāng)前一些研究顯示，在腫瘤轉(zhuǎn)移之前，依靠一部分原發(fā)腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(ePithelial mesenchymal transitions，EMT)等過程從而獲得高度的侵襲能力，從原發(fā)或者轉(zhuǎn)移灶脫落，進(jìn)入血液系統(tǒng)，大多數(shù)CTCs被機(jī)體免疫系統(tǒng)消滅，只有極少數(shù)侵襲力極高的CTCs存活下來并進(jìn)入到轉(zhuǎn)移臟器，進(jìn)而逃脫宿主的非特異免疫殺傷，增殖生長并最終形成轉(zhuǎn)移灶[4]。CTCs的檢測具有操作取樣簡單，可多次重復(fù)取樣，創(chuàng)傷小，患者易接受等優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)應(yīng)用于一些腫瘤相關(guān)的疾病，美國已批準(zhǔn)將循環(huán)腫瘤細(xì)胞應(yīng)用于乳腺癌和前列腺癌的篩查[5-6]。本文關(guān)于肺腺癌患者圍術(shù)期CTCs的研究表明，不論是微創(chuàng)還是開放肺腺癌切除術(shù)術(shù)中及手術(shù)后外周血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞量較術(shù)前均有所增加，提示手術(shù)過程中擠壓腫瘤組織可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞機(jī)械入血[7-8]。因此胸外科醫(yī)生手術(shù)過程中應(yīng)該堅(jiān)持無瘤原則，盡量避免對(duì)腫物的擠壓和搬動(dòng)。術(shù)后CTCs的數(shù)量顯著高于術(shù)前及術(shù)中，提示一方面由于手術(shù)創(chuàng)傷及手術(shù)應(yīng)激對(duì)患者生理內(nèi)環(huán)境、免疫功能的影響可能會(huì)減弱機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)CTCs防御。另一方面，不論是微創(chuàng)手術(shù)還是開放手術(shù)，在操作過程中不可避免的擠壓腫瘤組織，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不同程度的入血。外周血中CTCs數(shù)量的增多可能導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的幾率相對(duì)增加[9]。對(duì)于大多數(shù)肺腺癌患者而言，他們都死于腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，這可能與循環(huán)腫瘤細(xì)胞有密不可分的關(guān)系。CTCs作為新型的液體活檢手段，正在被越來越多的癌癥中心所接受。

本研究對(duì)不同手術(shù)方式肺腺癌患者CTCs變化的研究顯示，微創(chuàng)肺腺癌切除術(shù)組和開放肺腺癌切除術(shù)組術(shù)中外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量的變化無明顯差異。但微創(chuàng)組較開放組術(shù)后外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯降低，這些提示微創(chuàng)手術(shù)能顯著減少術(shù)后外周血中CTCs的量。且有研究顯示微創(chuàng)手術(shù)術(shù)后患者疼痛輕，皮膚創(chuàng)傷小，恢復(fù)時(shí)間快，患者機(jī)體免疫防御恢復(fù)快，有利于機(jī)體對(duì)CTCs的滅殺。

綜上所述，我們比較了微創(chuàng)肺腺癌切除術(shù)組和開放肺腺癌切除術(shù)組對(duì)肺腺癌患者圍術(shù)期外周血CTCs的影響。結(jié)果表明，微創(chuàng)手術(shù)有助于降低術(shù)后早期外周血中因手術(shù)播散的CTCs量，為術(shù)后患者的治療效果的評(píng)估以及臨床患者手術(shù)方式的選擇提供參考。然而本研究在樣本收集受到限制，因此得出的結(jié)論有一定偏差。